骨髓间充质干细胞在关节软骨损伤中的应用

刘志强，程红斌，刘建国＊，景元海

（1.吉林大学白求恩第一医院 骨关节二科，吉林 长春 130021；2.武警总医院 神经干细胞移植科，北京 1000397；3.大庆总医院集团龙南医院 骨科，黑龙江 大庆 163000）

骨髓间充质干细胞在关节软骨损伤中的应用

刘志强1，程红斌2，刘建国1＊，景元海3

（1.吉林大学白求恩第一医院 骨关节二科，吉林 长春 130021；2.武警总医院 神经干细胞移植科，北京 1000397；3.大庆总医院集团龙南医院 骨科，黑龙江 大庆 163000）

＊通讯作者

随着细胞生物学、分子生物学和材料学等基础科学的快速发展，组织工程研究和应用得以飞速发展，为软骨缺损修复这个医学难题开辟了全新领域。骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）在体外大量扩增对其最终在体内形成软骨组织无明显影响并可分化成软骨和骨组织，正是由于这些特性，使之成为组织工程软骨构建中热门的种子细胞。本文对BMSCs在软骨损伤中的应用进展加以综述。

1 软骨损伤机制

关节软骨的损伤根据损伤类型和修复反应的不同，可以被区分为3个等级：①软骨表面完好的软骨内损伤，伴或不伴软骨下骨损伤。②局限于关节软骨的非全层软骨缺损，未累及软骨下骨。③关节软骨并软骨下骨的全层缺损。关节表面完好的软骨内损伤病理改变为软骨基质断裂，存活软骨细胞可增强合成功能来修复组织。局限于关节软骨的非全层缺损无法自愈，通常认为损伤未及软骨下骨，无法引出骨髓中的干细胞。累及软骨和软骨下骨的全层缺损，由于损伤贯通软骨硬化区和软骨下骨，骨髓中的间充质干细胞等可迁至软骨损伤处，生成修复性的纤维软骨组织。这种修复组织在生物力学性能、耐久性等方面远不及健康软骨，但可覆盖、保护缺损区软骨下骨，减少软骨磨损和游离屑的形成。

2 骨髓间充质干细胞在关节软骨损伤中的应用

其基本方法是将自体或异体的组织细胞经体外培养扩增后，接种到一种生物相容性良好可吸收的生物材料上，形成细胞生物材料复合物，再回植到体内组织缺损部位，随着生物材料逐渐被机体吸收，细胞分化生长成新的有功能的组织，从而达到修复缺损的目的。主要涉及到种子细胞、支架材料和生长因子3个基本要素。

2.1 骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是目前研究最多、应用最广的种子细胞之一。它具有典型的干细胞特点，终身存在于骨髓和其他组织器官中，负责组织的修复和更新，而且具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下可以分化成许多不同的组织［1］。

2.1.1 骨髓间充质干细胞特点 骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下可以分化成许多不同的组织，如骨组织、软骨组织、脂肪组织、内皮组织、肌肉组织等。由于BMSCs的自我复制和多向分化的能力，近年来在组织工程骨构建过程中应用广泛。BMSCs取材方便、创伤小且易于从骨髓中分离及体外扩增纯化，不像滑膜、脂肪等来源的BMSCs原代培养需要酶消化预处理。骨髓BMSCs虽仅占有核细胞数的0.001%－0.01%，但始终稳定保持分化成软骨细胞的能力，是终身可用的软骨前体细胞。骨髓BMSCs具有CD105（即TGF-β受体），细胞成软骨潜能似与CD105表达有关。与滑膜、脂肪等来源的BMSCs相比，BMSCs标志基因在平面培养时差异不明显，而在三维高密度培养时基因差别显著，有且只有BMSCs的软骨分化才能获得明显的改善［2］。自体骨髓BMSCs不存在免疫排斥，且BMSCs体外基因转染高并能稳定高效表达外源基因等优点［3］。

2.1.2 骨髓间充质干细胞获得 随着对骨髓间充质干细胞深入广泛的研究，目前已建立了多种分离纯化的方法，为其在组织工程和基因工程上的应用奠定了基础。常用的骨髓间充质干细胞分离与纯化方法有：①密度梯度离心法。②贴壁细胞分离法。③ 流式细胞仪分选法。④磁珠分选法。

至今尚无明确的骨髓间充质干细胞鉴定方法，但利用骨髓间充质干细胞的一些生物学特征、表面标志物及特异性基因的表达，再借助一些实验技术，可基本达到区分它们的目的。关于骨髓间充质干细胞表面标志物的报道很多，但研究结论极不一致，尚缺乏单一明确的表面标志物［4，5］。

2.2 相关的生物活性细胞因子的选择

与BMSCs相关的细胞因子主要有转化因子-β（TGF-β）、骨形态发生蛋白（BMP）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、成纤维生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）等。

2.2.1 转化因子-β（TGF-β） 转化因子-β（TGF-β）是当前最强的细胞促生长因子。研究表明，TGF-β可以明显促进细胞外基质的合成，刺激Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达，增加成骨细胞数量。大多数离体研究表明TGF-β可增加成骨细胞分化标志物，如碱性磷酸酶、I型胶原、骨粘连蛋白的表达，还可增加碱性磷酸酶水平。另外，TGF-β1能减少胶原酶转录并加速胶原酶mRNA降解，这有利于维持骨中的胶原基质［6］。一些实验也说明了不同浓度的TGF-β1对BMSCs具有不同的诱导效率，10μg／L TGF-β1可能BMSCs向软骨细胞分化的最佳诱导浓度［7，8］。

2.2.2 骨形态发生蛋白（BMP） 骨形态发生蛋白（bone m0rphogenetic protein，BMP）是一组疏水性的酸性糖蛋白，属于转换生长因子超家族。是目前唯一被确认具有异位成骨能力的生长因子。其中研究最多也是成骨活性最强的是BMP-2和BMP-7。Lin等［9］研究发现：骨形态发生蛋白可以促进MSCs向成骨方向转化。

2.2.3 胰岛素样生长因子-1（IGF-1） 胰岛素样生长因子（IGF-1）是一种强有力的合成代谢刺激因子，是目前已知的调节软骨代谢和维持软骨内环境诸多因素中最关键的生长因子之一。研究表明胰岛素样生长因子1可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，还可抑制转化生长因子p1引起的细胞外焦磷酸盐的积聚，防止焦磷酸钙结晶的形成和进一步成骨，是转化生长因子β1重要的辅助因子［10］。

2.2.4 碱性成纤维生长因子（bFGF） 碱性成纤维生长因子（bFGF）是一种肝素粘合多肽，在人体组织中广泛存在，具有多种生物活性，包括促进毛细血管增殖、细胞有丝分裂，从而影响细胞的增殖和分化。实验发现bFGF可明显促进BMSCs的增殖并能增加传代的次数［11］。研究显示bFGF和地塞米松对骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响，结果显示1.0－10.0ng／ml的bFGF可促进BMSCs的增殖，浓度再高则促增殖作用无明显提高甚至下降。这说明bFGF对BMSCs的增殖有剂量依赖性［12］。

2.2.5 血管内皮生长因子（VEGF） 血管内皮生长因子（VEGF）又称血管通透因子（VPF）或（VAS）。近年来研究表明，血管内皮生长因子对中胚层细胞分化有作用，可以使骨髓间充质干细胞向成骨分化。

2.2.6 多种生长因子联合应用 软骨生长的微环境有很多生长因子，不同的生长因子相互影响，彼此形成复杂的网络关系，软骨生长、代谢需要多种生长因子共同参与。目前研究者关注多个因子的联合应用以及其他因素与因子间的相互作用。

Ozono［13］分别将bFGF与IGF、17β-雌二醇（E2）联合应用，结果表明联合使用能更有效地促进骨髓间充质干细胞的成骨性分化。TGF-β1、BMP-2联合作用更能促进 BMSCs向软骨细胞诱导分化，分泌软骨特异性基质［14］。多个因子的联合应用可以更好地修复软骨缺损使其成为当今组织工程的研究热点，但并非所有的生长因子之间的组合都是有利的，研究发现胰岛素样生长因子1、转化生长因子β联合应用修复软骨并没有得到明显的改善，机械强度也没达到理想强度［21］。

2.3 支架材料的选择

组织工程中支架材料即人工的细胞外基质。理想的软骨组织工程支架材料应具有：① 良好的生物相容性，利于细胞贴附，无毒性，不引起炎性反应，不能引起宿主的排异反应。②可塑性和一定的力学强度：可预先制作成一定形状并为新生组织提供一定强度的支撑，且可保持至新生组织具有自身生物力学特性。③良好的生物降解性：材料降解速率与种植入的细胞组织形成的速率匹配，组织再生后则被完全降解吸收，同时降解产物无毒，能及时排出体外。④具有三维立体多孔结构且至少达90%大小合适的孔隙，为大量种子细胞的黏附、生长、营养、代谢等提供良好条件，同时还能让血管长入支架。⑤良好的表面活性：激活细胞特异基因表达，维持细胞表型正常表达。⑥价格低廉，来源广泛，可以大量重复生产。目前与骨髓间充质干细胞复合应用得较多的支架材料有以下几种。

2.3.1 多孔生物降解聚合物 多孔生物降解聚合物中较常用的是聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）及其共聚物（PLGA）。其中，PLGA是目前应用比较广泛，具有低降解度和高药物渗透性的特点，具有良好可吸收性的生物降解可植入高分子材料。有学者通过将骨髓间充质干细胞接种到PLGA纳米纤维支架上，发现两周后骨髓间充质干细胞能持续分化成成骨细胞及成软骨细胞［15］。

2.3.2 胶原 胶原是多种组织的主要成分和细胞外基质蛋白，在体内以胶原纤维的形式存在，其纤维状结构利于组织培养中细胞的黏附生长繁殖。胶原不论是作为皮肤、骨胳替代品，生物工程膜，或组织培养系统支架，应用都越来越广泛。研究表明骨髓间充质干细胞为种子细胞，复合胶原凝胶移植，修复关节软骨缺损，确定良好效果。

2.3.3 壳聚糖 壳聚糖（chitosan，CS）通过甲壳素壳聚糖β－（1-4）聚-2-乙酰胺基-D-葡糖脱乙酰化形成，具有良好的生物相容性、可降解性，近年来成为生物医学工程领域研究较多的材料之一。实验发现将骨髓间充质干细胞放在壳聚糖－珊瑚复合支架上培养，发现骨髓间充质干细胞的贴附、增殖和成骨分化能力都优于单纯的壳聚糖支架［16］。

2.3.4 种子细胞-支架复合物 BMSCs复合三维PLGA支架应用显示：用兔自体骨髓血分离出骨髓间充质干细胞种植于三维PLGA支架，共同体外培养2周后移植修复兔膝关节软骨缺损。术后4周，骨软骨缺损被新形成的光滑白色组织所填充，但是边缘与周围正常软骨组织有颜色不同的界限。组织学观察有培养的细胞和细胞外基质。术后12周，缺损处填充以光滑、白色并有光泽的组织，类似完整的关节软骨边缘与正常软骨组织模糊。组织学观察有再生的类透明软骨和大量细胞外基质［17］。

2.3.5 种子细胞-支架-细胞因子复合物 将携带 TGF-β1凝胶微球（MS-TGFβ1）的多孔水凝胶-软骨素-透明质酸支架复合自体BMSCs培养后修复兔全层关节软骨缺损，通过观察，再生软骨细胞在形态学、整合性、与软骨下骨的连续性及再生软骨层的厚度方面均获得了更好的修复［18］。

2.4 物理环境影响

同时力学环境也起到一定促进分化作用。适当的动态压缩和由纤维蛋白与弹性PLCL混合成的支架三维环境下，可以促进BMSCs分化成软骨细胞，保持其表型和促进聚糖的产生，从而改善软骨组织在体内和体外的质量［19］。振动拉伸载荷的差异能够影响三维纤维蛋白凝胶对关节软骨细胞亚群的构造，暴露于特定拉伸载荷的细胞被分成了向深层区域发展和浅层的软骨细胞，这可能表明了细胞对新的力学环境的适应。单一周期（40min，2 000με）的机械张力提高其碱性磷酸酶的活性，显著上调TGF-β和IGF-Ⅱ的表达，还可促进BMSCs增殖［20］。目前，已证实了应力刺激确实有利于BMSCs向软骨细胞的诱导分化，但在体外诱导中最佳的施力大小，施力方式及作用时间等尚不明确，需要进一步研究探索［21］。

2.5 基因转染技术

用基因芯片技术建立妊娠胎鼠肢芽软骨发育过程的基因表达谱，分析MAPK信号通路中bFGF在软骨发育过程中的基因表达规律，发现FGF能够启动MAPK信号通路从而促进软骨形成。bFGF质粒转染BMSCs后促进BMSCs的增殖，细胞有向软骨细胞分化趋势。

龙华等［22］以腺病毒AdEasy为基因转移载体，制备携带转化生长因子β1和骨形态发生蛋白7基因的高滴度腺病毒感染兔间充质干细胞与骨基质明胶（BMG）支架相复合体外构建组织工程化软骨，移植修复同种异体兔关节软骨缺损，经组织染色和电镜观察可见前体软骨细胞大量增殖，在体移植修复实验组新生组织为类透明软骨，修复效果明显优于各对照组。得出间充质干细胞经携带转化生长因子β1和骨形态发生蛋白7基因的腺病毒感染后，体外能向软骨细胞作定向分化，可用于制备组织工程化软骨，使提高关节软骨缺损的修复质量成为可能。

基因治疗现在还处在实验探索阶段，还存在许多问题如安全性能问题，基因调控性差，转染率较低等问题，但随着对软骨细胞损伤机制研究深入，基因转染技术的改进，基因治疗将会在软骨细胞修复中广泛应用。

3 小结及展望

以干细胞工程为代表的现代组织工程学是近年来迅猛发展的新领域，干细胞工程作为组织工程的前沿研究，对未来的组织器官修复与替代具有极其重要的作用和深远的影响。尽管还有许多问题需要进一步研究，但骨髓间充质干细胞使关节软骨缺损的修复已跨入了临床应用干细胞治疗的时代，有理由相信随着研究的深入和应用的推广，一定会将组织工程化软骨更好的应用于临床。

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