细胞信号通路与动脉粥样硬化

卢琼，谭睿，崔文婷，蔡少青

细胞信号通路与动脉粥样硬化

卢琼，谭睿，崔文婷，蔡少青

心血管疾病是当今世界导致人类死亡的头号疾病杀手，动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是其中常见的一种血管病变。目前认为，动脉粥样硬化是由单核/淋巴细胞黏附并激活内皮细胞（EC）而开启的由多种原因导致的疾病[1]。伴随着对其研究的深入，越来越多 AS 相关的细胞因子及信号通路被发现，介导细胞因子活性的信号通路在 AS 的发生、发展中有重要作用。对这些细胞因子及信号通路的广泛研究将有助于我们寻找新的抗 AS 药物，并进一步从分子水平研究药物抗 AS 的作用机制。本文总结了动脉粥样硬化中相关的信号通路，并对中药抗 AS 作用研究进行了展望。

1 炎症通路与 AS

在 AS 形成发展的整个过程中，从早期炎症反应期、脂纹期到成熟斑块期以及斑块破裂期，始终都有各种炎症细胞及因子的参与。众多炎性细胞因子、黏附因子、趋化因子等相互作用，相互交联，扩大炎症反应的级联，促成了 AS病变的发生和发展。“炎症学说”、“损伤-反应学说”已成为AS 发病机制的主流学说之一[2]。核转录因子-κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-aetivated protein kinase，MAPK）、Janus 激酶-信号转导转录激活因子（JAK-STAT）以及 T 细胞共刺激分子介导的共刺激信号通路，在炎症信号转导中具有重要意义。

1.1 NF-κB 信号通路与 AS

NF-κB 是最初在鼠成熟 B 细胞和粒细胞瘤中发现并命名为细胞核 Kappa 轻链基因表达的调节子。NF-κB 是NF-κB/Rel 家族中的一员，由家族中的 p50 和 p65 组成，通常以同源或异源二聚体 p50/p65 非活性形式存在于几乎所有类型细胞中。其中 p65 能够使调控基因转录活性增强，p50 则与调控基因结合的亲和力有关。在胞浆内，p50/p65二聚体与 NF-κB 抑制蛋白（IκB）结合，隐藏 p65 与靶DNA 结合的关键氨基酸残基，抑制 NF-κB 与靶 DNA 调节区的特异性结合。一旦被病毒、氧化剂、炎症细胞因子等刺激剂激活，便会与抑制蛋白（IκB）解离，转入核内与靶基因的启动子或增强子的 κB 位点结合，进而调控基因的表达[3]。

NF-κB 参与炎症反应中的多种信号转导途径，激活后可促进促炎细胞因子、黏附分子、趋化因子、生长因子以及环氧合酶 2（cyclooxygease-2，COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等氧化应激相关酶基因的过度表达，引起明显的炎症反应，进而诱导 AS的发生。研究发现，动脉粥样硬化病灶的巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等多种细胞中均存在活化的 NF-κB。用高脂饮食喂养低密度脂蛋白受体基因缺陷（LDLR-/-）的小鼠，早期即可在小鼠主动脉根部的内皮细胞中发现核因子 κB的活化，并且发现该部位逐渐发展成为动脉粥样斑块[4]。抑制 NF-κB 通路活化则有助于缓解动脉粥样硬化。姜黄素通过抑制 AS 过程中 NF-κB 的表达，抑制炎症因子的产生，减轻 AS 炎症反应[5]。通过 RNAi 技术沉默巨噬细胞Ana-1 NF-κB p65 基因，发现经 NF-κB p65 基因沉默的Ana-1 细胞受 LPS 刺激后促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 的表达明显减少，抑炎因子 IL-10 的表达增多[6]。

泡沫细胞的形成和巨噬细胞炎症反应是 AS 过程中的两个重要事件。已证实脂肪细胞增强子结合蛋白 1（adipocyte enhancer-binding protein 1，AEBP1）在 AS 中扮演重要的调控作用，通过下调 IκBα 诱导核因子 NF-κB 产生活性，进而促进巨噬细胞炎症反应。这意味着巨噬细胞 AEBP1 可作为预防或治疗 AS 潜在的治疗靶点[7]。而炎症反应中常见的高度乙酰化则表明组蛋白乙酰转移酶（HATs）的小分子抑制剂有抑制炎症的潜能[8]。研究还发现，miroRNAs（miR-146、miR-155、miR-181b、miR-21 以及 miR-301a）与凋亡抑制蛋白（IAP）在 NF-κB 活化中均起到一定作用[9-10]，这些都有可能为 AS 治疗提供新的靶点。

1.2 MAPK 信号转导通路与 AS

MAPK 是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，由多种同工酶组成，包括细胞外调节蛋白激酶（extra cellular regulated protein kinases，ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/应激活化蛋白激酶（SAPK）、ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶（BMK1）和 p38 MAPK[11]。MAPK 信号转导以三级激酶级联的方式进行，首先 MAPKKK 受有丝分裂原刺激磷酸化而激活，然后 MAPKKK 磷酸化激活MAPKK，最后由 MAPKK 磷酸化激活 MAPK，进而转入核内发挥作用。ERK、JNK、p38、ERK5/BMK1 可以由不同的刺激因素激活，形成不同的转导通路，激活各不相同的转录因子，介导不同的生物学效应，但这几条通路存在广泛的“cross talk”，从而导致通路间产生相互协同或抑制作用[12]。MAPK 途径是介导细胞反应的重要信号系统，普遍存在于多种生物，参与细胞生长、发育、分裂、死亡以及细胞间的功能同步等多种生理反应的过程。

其中 ERK、JNK 以及 p38 在动脉粥样硬化中具有重要作用，许多促炎基因包括编码 TNF-α、IL-2、IL-6、E-选择素、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1 和 COX-2 等的基因表达均受到这些通路的调节。郭津和徐长庆[13]发现在大鼠动脉粥样硬化模型中，促凋亡 JNK 和 p38 蛋白激酶被激活，抗凋亡 ERK1/2 也被激活，抑制或减轻细胞凋亡可有效防止 AS 的发生与发展。血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）功能障碍不仅是 AS 的早期病理改变，也是使动因素，在 AS 的发生、发展过程中起着关键性的作用。近年来研究发现，在 AS 病理生理状态下，某些病理因素如细胞因子、细菌产物、氧化脂蛋白、晚期糖基化终产物和高半胱氨酸均能够导致 VEC 中 ERKs 蛋白水平的改变，因而认为 ERK 的激活与调节是 AS 发生发展的始动机制之一[14]。研究发现，多球壳菌素通过抑制 ERK 磷酸化上调肝脏载脂蛋白 A-I 表达[15]，从而达到抗 AS 的目的。抑制 JNK 和 p38 蛋白激酶同样可达到抗 AS 的效果。与载脂蛋白 E 基因敲除小鼠比较，JNK2 缺失的载脂蛋白 E 基因敲除小鼠动脉粥样硬化损害明显减少[16]。当归补血汤下调 p38 MAPK 活性，避免了 ox-LDL 诱导单核细胞聚集到血管内皮，从而在 AS 病变的早期发展阶段阻断其进程，缓解后期病变的发展[17]。

1.3 JAK-STAT 信号通路与 AS

JAK/STAT 途径是细胞因子信号转导的重要途径之一，不仅参与炎症反应，同时也与氧化应激、细胞损伤、凋亡等密切相关[18-19]。JAK 家族包括 JAK1、JAK2、JAK3 和TYR2 4 个成员。STAT 家族包括 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和 STAT6 共 7 个成员。细胞膜上的各种细胞因子受体与相应的配体结合，形成同源或异源二聚体后，促使细胞质内的 JAKs 相互磷酸化而被激活，活化后的 JAKs 磷酸化其受体酪氨酸残基，STAT 补位到受体复合物的酪氨酸磷酸化特异位点，JAKs 接近 STATs 并磷酸化 STAT 的一个羟基酪氨酸，从而激活 STAT。活化后的 STAT 与受体分离，形成同源二聚体或异源二聚体，然后转位到细胞核，与 DNA 上的特定调节序列结合，调节基因的转录[20]。JAK/STAT 通路调控的基因包括凋亡相关基因如 Fas、Bcl-2、Bax，炎性相关基因如 COX-2、iNOS、IL-8、IL-6 及其他如内皮素 1（ET-1）、NADPH 氧化酶基因等[21]。

实验证明 JAK/STAT 信号通路在 AS 的发生发展中可能发挥重要作用。Gharavi 等[22]发现磷酸化激活的STAT3（P-STAT3）主要存在于动脉粥样硬化斑块炎症区的内皮细胞中，而在其他炎性细胞中较少，非炎症区则几乎没有。比较 STAT3-/- 小鼠（内皮细胞敲除 STAT3 的小鼠）和 STAT3+/+ 小鼠（野生型的小鼠），发现在斑块大小、巨噬细胞及 P-STAT3 的含量上 STAT3-/- 小鼠都明显低于STAT3+/+ 小鼠。而 JAK/STAT 的抑制剂可以通过抑制INF-γ 诱导的人血管平滑肌细胞 Nox 的活性[21]，从而减少氧自由基的产生，减少细胞的氧化损伤。

此外，有研究报道 T 细胞共刺激分子介导的共刺激信号通路与 AS 也有密切关系。T 细胞介导的针对斑块抗原的适应性免疫应答反应是一系列炎症反应的主要环节[23]。T 细胞促 AS 主要是通过 T 细胞共刺激分子介导的信号通路。T 细胞表面的 CD40 分子，被认为是首要的共刺激物；主要表达于某些动脉粥样损害部位的细胞：内皮细胞，T 细胞，B 细胞，巨噬细胞及血管平滑肌细胞[24]。T 细胞表面的 CD40 分子与 B 细胞、巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞表面的 CD40 受体配对后可上调共刺激分子（ICAM-1、VCAM-1、E-Selectin、B7-1、B7-2、MHCII 类分子和 CD40）的活性，并促进 IL-2、IL-1、IL-6 和 TNF-α等促炎细胞因子的产生，进而促进动脉粥样硬化的形成[25]。

2 泛素-蛋白酶体通路与 AS

泛素-蛋白酶体（ubiquitin-proteasome system，UPS）途径是细胞内非溶酶体途径蛋白质降解通路，广泛存在于真核生物细胞中，由泛素（Ub）、泛素活化酶（E1）、泛素偶联酶（E2s）、泛素-蛋白连接酶（E3s）、26S 蛋白酶体以及泛素再循环酶等组成[26]。UPS 对蛋白质的降解包括两个连续的步骤：①在多种蛋白酶的作用下，Ub 分子结合底物蛋白并标记；②标记了的底物蛋白，被 26S 蛋白酶体识别并降解。UPS 除了介导蛋白降解外，还在抗原提呈、细胞周期、NF-κB 代谢、基因转录及表达等方面发挥重要调控作用[27]，UPS 的异常则与许多疾病如肿瘤、炎症、动脉粥样硬化、心功能不全、高血压等的致病机制有关。

最近有证据显示，在 AS 初期、发展期以及 AS 的并发症期，都可能有 UPS 的参与。在血管平滑肌细胞（SMCs）从收缩型向增殖型转变过程中，UPS 起着重要的作用。这可能是由于新内膜泛素化增加，导致 SMCs 内的肌原纤维蛋白降解增加所致[28]。UPS 还可聚集 ox-LDL 或 LDL，诱导人单核细胞泛素偶联酶 E2-25k 表达并泛素化细胞内蛋白，参与泡沫细胞形成。研究发现在人 AS 的冠状动脉内，泛素与 SMCs 肌动蛋白的免疫反应，同时出现在新内膜的基底部；而用蛋白酶体抑制剂处理 SMCs，细胞的增殖及凋亡呈剂量依赖性抑制，同时 NF-kB 的活性降低而 p53和 p21 表达上调[29]，这表明 UPS 与 SMCs 内膜增生密切相关，抑制其活性可能从某种程度上达到抗 AS 的目的。虽然外源性的蛋白酶体抑制剂己成功地用于癌症的辅助治疗，具有上调 p53、p21 及 Bax 等促凋亡因子及抗增殖的作用。然而，能否防治 AS，还有待进一步研究[30]。

3 Rho/Rho 激酶信号通路与 AS

Rho 是一种小分子 G 蛋白，包括 3 个亚型：RhoA，RhoB，RhoC。Rho 激酶（Rho-associated coiled-coil forming protein serine/threonine kinase，ROCK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要包括氨基端的催化结构域（即激酶域，kinase domain）、中间的 α 螺旋区（包含 Rho 蛋白结合结构域，Rho-binding domain，RBD）和羧基端富含半胱氨酸的 pH 结构域（pleckstrin-homology domain，PHD）。ROCK的活性受细胞外信号和一些胞浆蛋白的调节。当 ROCK 接受 Rho 传递的活化信号后，会发生多个氨基酸位点的磷酸化而被激活，并介导其下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应。

ROCK 的异常活化与许多心血管疾病包括 AS 的发病机制密切相关。近年来关于 ROCK 在 AS 中作用的研究发现：① Rho/ROCK 通路参与的各种细胞功能在 AS 的发生发展中发挥作用；② Rho/ROCK 通路通过多种血管活性物质，参与 AS 的病理生理过程；③他汀类药物的降脂作用，也与抑制 Rho/RocK 相关[31]。ROCK 通过参与细胞迁移、黏附、炎症反应、平滑肌细胞收缩，胞质分裂及下调一氧化氮合酶（eNOS）合成和表达导致动脉粥样硬化[32]。抑制ROCK 的活性，能够减少相关黏附分子的表达，阻止 AS 的发展。在 ROCK1 基因敲除小鼠中，ROCK1 活性抑制可以减少细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的表达，从而减少血管损伤后新内膜的形成[33]。张曼等[34]的研究也证实了 Rho 激酶抑制剂法舒地尔可通过下调 ICAM-1、VCAM-1 以及 Rho 激酶 mRNA 的表达，抑制动脉粥样硬化斑块形成。

4 TGF-β/Smads 信号通路与 AS

转化生长因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一组具有多种调节细胞功能作用的结构相似的转化生长因子。在哺乳动物中，TGF-β 超家族有 3 种同分异构体：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，主要通过 Smad 家族蛋白进行信号传递。根据功能的不同 Smad 蛋白分为 3 种：①受体调节型，包括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 和 Smad8；②公共型，包括 Smad4；③抑制型，包括 Smad6 和Smad7[35]。在信号转导中，TGF-β 活化后首先与 TβR-II 结合，形成异源二聚体复合物，TβR-I 识别并结合该二聚体复合物。TβR-II 磷酸化 TβR-I 胞浆区 GS 结构域的丝氨酸/苏氨酸激活 TβR-I，R-Smads 蛋白被活化的 TβR-I 磷酸化后与 Co-Smad 结合成为转录复合物，转入细胞核内，与DNA 上的 Smad 结合元件相结合，从而激活特定的靶基因[36]。

TGF-β/Smads 通路在 AS 的发生发展过程中发挥着重要的作用。TGF-β 控制的细胞增殖，细胞迁移，基质合成，伤口收缩，钙化和免疫应答，均是动脉粥样硬化过程中的重要过程。在 AS 早期，Smad3 高表达可以促进血管平滑肌细胞增生，内膜增生，参与 AS 的发生发展；在 AS 后期，TGF-β/Smads 通过促纤维化以及抗炎作用起到稳定斑块的作用[37]。TGF-β/Smads 通路还能够抑制 MCP-1 的表达，从而抑制 MCP-1 介导的单核/巨噬细胞聚集以及趋化，防止内膜增生、内皮活化。其机制是 Smad3 与转录调节因子c-jun 结合，进而抑制活化蛋白 1（activator protein-1，AP-1）结合 DNA[38]。在野生型小鼠中，血管紧张素 II（angiotensin II，Ang II）通过 TGF-β 信号通路上调 Smad3，促使血管平滑肌细胞中胶原合成增多，从而引起血管纤维化；但是这种现象在 Smad3 基因敲除小鼠中并未出现[39]。

5 Toll 样受体信号通路与 AS

Toll 样受体（Toll-like receptor）是人们在研究果蝇胚胎发育过程中发现的 dToll 基因所编码的一种跨膜受体蛋白，到目前为止 TLR 家族至少已包括了 12 个成员。其中TLR4 是介导内毒素/脂多糖（lipopo-lysaccharide，LPS）应答的最主要受体[40]。TLR 激活后信号途径大致可分为MyD88 依赖途径和非 MyD88 依赖途径。其中 MyD88 是除 TLR3 外所有 TLRs 的衔接蛋白。MyD88 依赖途径主要引起核因子 κB 易位进入细胞核内进而诱导免疫基因如单核细胞趋化蛋白、细胞黏附分子、白细胞介素等的转录；非 MyD88 依赖途径主要激活干扰素调节因子 3（interferon regulated factor 3，IRF-3）并引起 I 型干扰素（type 1 interferons，IFNs）的转录[41]。

外源性配体 LPS 和内源性配体脂蛋白等均可通过TLR 刺激免疫细胞在内引起持续的慢性炎症反应，促进AS 的形成。张代娟等[42]研究发现中药成分青心酮可通过TLR4 途径下调 LPS 活化的小鼠平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞 TLR4 mRNA 和蛋白的表达，在一定程度上减少AS 病灶的形成。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是单核细胞迁移到血管的重要细胞因子，与动脉粥样硬化的发病机制相关。研究发现在野生型小鼠的骨髓源性巨噬细胞出现了MCP-1 的诱导，而在 TLR2 的基因敲除小鼠中则没有[43]。用 ox-LDL、LPS 刺激 APOE 基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞，可以诱导泡沫细胞的形成，细胞内 TLR4 的表达显著升高[44]。这些基因敲除鼠研究结果均提示 TLR 在 AS 的发生和发展中起重要作用。

此外，越来越多的证据发现 Wnt 信号通路在 AS 中参与涉及多个过程。Wnt 信号通路不仅调节血管内皮功能障碍和血管平滑肌细胞增殖、迁移，而且还具有调节炎症、泡沫细胞的形成、病理血管生成和钙化的能力，这些都是斑块形成和稳定的关键过程[45]。虽然 Wnt 信号通路在动脉粥样硬化的系统分析尚未完成，但很明显，对 Wnt 信号通路更深入地了解可能揭示血管疾病新的治疗靶点。

6 结语

随着时代的进步，科技的发展，生物技术在医药领域中发挥了越来越重要的作用。在国际上，斑马鱼模式生物由于其繁殖能力强、体外受精发育、胚胎透明、个体小、易养殖以及可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选等诸多特点，正逐渐被应用于多种疾病（如神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等）的研究和小分子化合物的大规模新药筛选[46]。此外，运用细胞及分子生物学手段构建含有编码信号通路目的基因片段的重组质粒（质粒通路模型），进行大规模的新药筛选，也成为近年来的研究热点。大量研究发现许多中药提取物、中药单体成分、单味中药和复方中药对动脉粥样硬化都有显著疗效[5,17,42]，但很多中药的作用机制并不是很清楚；而靶向于细胞因子及细胞内信号转导通路的抗 AS 治疗方法直接针对疾病的本质，作用机制清晰。因此，将新兴的生物技术应用于中药研究，将有助于发现新的抗 AS 中药成分，阐明中药成分的作用机制，并促进中药的现代化。对 AS 相关细胞信号通路的深入了解以及从细胞和分子水平开展前瞻性的基础实验研究，可望给 AS及中药作用机制研究带来突破性进展。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.010

国家自然科学基金面上项目（81173594）；“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09502-023）；中央高校基本科研业务费专项资金（SWJTU11ZT26）

610031 成都，西南交通大学生命科学与工程学院（卢琼、谭睿、崔文婷）；100191，北京大学药学院（蔡少青）

谭睿，Email：tanrui@swjtu.edu.cn

2012-03-06