多能干细胞向肝细胞分化的微环境

周文丽 朱樑

一、背景

终末期肝病（end stage liver disease，ESLD）指各种原因如肝炎、肝硬化、肝癌、药物性肝损伤和自身免疫肝病等导致肝功能极度减退甚至衰竭的一种病理状态。它是很多肝脏疾病的终末状态，预后较差，在发展中国家的发病率逐年上升[1]。目前治疗肝癌或终末期肝病的理想方案是肝移植[2]，但是供肝不足和免疫排斥是目前移植的两大难题[3],因此寻找其他高效的替代治疗措施显得尤为重要。近年来干细胞生物学研究取得了很多进展，能为细胞移植和生物人工肝提供充足的高活力的肝细胞，这为ESLD的治疗带来了希望。

目前可用于ESLD治疗的细胞主要包括双能干细胞（如肝母细胞和卵圆细胞）、多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）、由干细胞分化而来的肝细胞、人原代肝细胞和肝癌细胞株等。但随着研究的深入，发现了一些细胞在细胞治疗方面的局限性，如卵圆细胞缺乏特异性的表面标记、体外扩增能力较差，人原代肝细胞来源有限、寿命较短等。因此研究者将目光转向了PSCs。PSCs目前没有一个明确和统一的定义,常指具有分化成多种细胞潜能的干细胞系细胞。广义的PSCs包括胚胎干细胞（human embryonic stem cells ，hESCs）、诱导多分化潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）以及间充质干细胞等；狭义的PSCs主要指hESCs和iPSCs，这也是本文讨论的重点。

hESCs来源于植入前囊胚内细胞团，具有体外无限增殖能力且能在特定条件下分化为多类成体组织或胚外组织的细胞群体[4-5]。Rambhatla等[6]首次报道了hESCs直接分化产生肝细胞样细胞(hepatocyte-like cells,HLCs) ，此后很多实验室建立了不同的实验方案以生成HLCs。胚胎小体（embryoid body，EB）形成可使hESCs分化成包括肝细胞在内的很多类细胞。然而由于EB分化的不可控性，现在人们广泛采用单层细胞培养系统使hESCs直接分化为肝细胞，该方法能从hESCs高效获得HLCs 或肝细胞[7]。Yamanaka等[10]采用体外基因转染技术从24个基因中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个参与维持细胞多分化潜能的转录因子，随后成功地将成纤维细胞诱导成iPSCs[8-9]。随着研究的深入，目前已逐渐建立了iPSCs向肝细胞分化的有效模型。

hESCs和iPSCs技术的发展为肝再生医学开辟了新纪元，PSCs能分化为成熟的肝细胞，可用于细胞移植和生物人工肝等细胞治疗，这也意味着用于该领域的细胞必须稳定、可靠、安全。Payne等[11]发现在体外内胚层和中胚层细胞以不合适的比例混合使组织稳定性下降最终导致肿瘤生成。亦有研究表明在细胞移植治疗小鼠模型中iPSCs对肿瘤的形成有重要影响[12]。HLCs移植后肿瘤的形成，主要原因是对肝细胞分化的过程和影响因素认识不清，因此深入研究肝细胞分化将有利于提高细胞治疗的细胞纯度和肝细胞功能，降低移植后肿瘤的发生率。此外，近年来采用直接分化的方法能产生具有肝细胞功能的HLCs，但仍然存在一些细胞分化培养相关的问题，如HLCs培养一段时间后去分化和死亡；实验室分别采用自己建立的分化方案而导致分化微环境各不相同。在干细胞向肝细胞分化过程中，组织微环境起着极为重要的作用，建立标准的ESCs和iPSCs培养规范，改善和优化培养微环境，对保证生物医学研究的准确性和真实性，最终利用这些细胞进行临床应用具有重要意义。培养基的配方（包括各类生长因子及激素等的添加）、基质材料对细胞支持、动态培养方式与其他肝非实质细胞的共同培养等均为肝细胞分化微环境的重要因素，本文对PSCs向肝细胞的分化微环境研究进行综述。

二、PSCs向肝细胞分化的微环境

ESCs和iPSCs常用的分化方法分为三类：无血清和富血清培养基、与细胞共培养、转染肝脏特异性基因。早期ESCs和iPSCs采用悬浮培养形成EB，能为肝脏内胚层(hepatic endoderm，HE)分化和成熟提供微环境，最终可以形成含3个胚层的细胞群,其特点是具有空间三维结构，与胚胎发育过程相近[4]。但由于细胞增殖的不可控性和操作难度大而逐渐被新的分化方法所取代。近年来普遍采用PSCs直接分化的方法产生具有肝细胞功能的肝脏内胚层或肝细胞样细胞，值得提出的是iPSCs的分化绝大多数实验室都采用ESCs的分化诱导条件。

在多种细胞因子的作用下，hESCs 先分化得到限定性内胚层细胞（definitive endoderm cells，DE），进一步分化为肝细胞等内胚层细胞，此后肝诱导分化使细胞表达成熟肝细胞相关基因。肝脏细胞增殖和功能分化过程中,肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、制 瘤 素 (oncostatin M,OSM)、激活素和糖皮质激素,Wnt,Notch 都起着重要的作用。D’Amour等[13]用富含Activin 培养基成功诱导肝细胞分化,Cai等[14]采用单层诱导结合FGF-4和BMP-2 诱导hESCs 获得HLCs，用OSM进一步诱导肝细胞分化成熟。Hay等[7]采用三阶段培养方法，用Wnt3和Activin A直接诱导hESCs 向DE的分化，在肝诱导分化第三阶段添加HGF 和OSM促进肝细胞成熟，使hESCs直接分化成HLCs的效率达到90﹪。此外，一些研究团队亦在致力于诱导分化培养方案的改良。Shirahashi等[15]对mESC和hESC定向分化为肝细胞过程中的生长和分化诱导条件进行了比较、优化，发现在Ⅰ型胶原包被条件下利用添加有20﹪胎牛血清、胰岛素和地塞米松的IMDM培养基有利于肝细胞的分化。Momose等[16]发现与胶原和明胶相比，细胞外基质能显著诱导肝细胞特异性基因的表达提高细胞色素P450代谢的活性。Tuleuov等[17]开发了新的高效细胞培养系统，肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子和骨生发蛋白与纤连蛋白、I型胶原混合后点到玻片上作为细胞培养载体，此后加入肝星状细胞，发现肝细胞分化明显提高。从近年大量干细胞向肝细胞分化的研究不难发现，肝细胞分化受到多种细胞因子不同程度的调控，其中成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGFs）和骨形态发生蛋白（bone morpho-genetic proteins，BMPs）家族因子在肝细胞的增殖和定向分化具有重要调控作用；明确各种细胞因子在肝细胞分化中的作用，改良分化培养基配方和改善细胞培养支持系统将可提高肝细胞诱导分化效率和肝细胞功能。

某些基因表达改变也在PSCs诱导肝细胞分化和再生中起着重要作用。肝细胞核因子4a(hepatocyte nuclear factor 4a,HNF4α)是肝细胞分化成熟的重要转录因子，上调hESCs HNF4α表达后可明显增强载脂蛋白、醛缩酶B、苯丙氨酸羟化酶、TFN和视黄醇结合蛋白等基因表达[18]。Razvan等[19]发现肝前体细胞转染Hnf4α ，Foxa2和C/ebpα后培养1周，诱导的细胞呈现肝细胞的上皮表型，并对与肝细胞功能相关的基因和蛋白表达进行检测，发现白蛋白的分泌能达到正常原代肝细胞水平，糖原储备能力增强，但尿素生成能力与原代肝细胞相比较差。最近有研究报道大鼠成纤维细胞转导Gata4,Hnf1α and Foxa3和失活 p19Arf后能直接产生有功能的HLCs，且不会逆转成肝前体细胞，采用该细胞进行细胞移植，能使几乎半数乙酰水解酶缺陷（人体中称为遗传性酪氨酸血症）肝衰竭小鼠模型存活，且细胞移植两个月后没有肿瘤形成[20]。由此可见，通过调控PSCs向肝细胞分化过程中特定基因的表达，对肝细胞的分化和培养亦具有重要意义。

三、人肝脏发育对肝细胞分化研究的启示

胚胎发育早期，胚层分化并形成3个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。内胚层能够分化形成肝脏、胰腺、甲状腺和肺等；中胚层参与了肝脏间质的形成。当内胚层开始分化时（人妊娠3～4周），内胚层和中胚层的组织发生相互作用，肝憩室形成。这个阶段的细胞称为肝母细胞，开始检测到CK19 和肝细胞抗原1（HepPar1）表达[21]。中胚层和隔间质分泌的FGFs和BMPs在诱导肝细胞分化发育中发挥重要作用[22]；Wnt信号通路在此阶段能发挥抑制作用以维持前肠的完整性，在肝脏初始诱导发育中具有重要作用[23-24]。肝脏内胚层增厚形成圆锥状的上皮，此后肝母细胞离开内胚层上皮而迁移穿透隔间质的基膜。一旦肝芽（liver bud）长入肝间质中，肝母细胞形态发生剧烈变化，失去上皮细胞的形态，在一系列的细胞因子和生长因子作用下发生肝细胞的增殖和分化[25]。大约孕6周时，胆管清晰可见并和消化道连通，肝脏结构更加明显，肝血窦明显增多。孕7～8周时CK14出现于肝母细胞胞浆中，其分化成肝细胞和胆管细胞[21]。很多因子参与了肝脏的分化成熟，如Wnt3,HNF-1α,HNF-1β,FoxA2,HNF-4α1,HNF-6和LRH-1等参与了肝细 胞 的 分 化[7,26-28]；Wnt,HNF-1β,FoxA2,HNF-6,Sox9,and OC-2等参与了胆管细胞的分化[29]。肝细胞 (α-fetoprotein+/albumin+) 和胆管细胞 (CK-19+) 逐渐成熟，发生形态改变并逐渐具备功能，这一过程一直持续到出生后的几周内。

在肝脏分化成熟的发育过程中，很多因子参与肝脏的分化成熟，它调控了肝脏发育的多个阶段和重要事件。目前广泛采用的直接诱导分化体系绝大多数正是基于肝脏胚胎发育过程中生长因子的时空变化而设计分化方案。进一步深入研究人肝脏发育对诱导肝细胞分化具有重要指导意义，可根据正常肝脏体内发育的规律，应用肝脏发育所需的生长因子设计培养基，诱导PSCs定向高效分化为肝细胞，为临床ESLD进行细胞治疗等应用提供大量优质高效的肝细胞。以Wnt3a为例，该信号通路在hESC向肝细胞分化过程中对维持肝细胞的功能具有重要作用。Wnt/β-catenin信号通路参与了胚胎向中胚层和内胚层的发育，以及内胚层向肝细胞和胆管细胞分化过程[7,30-32]，基于这些理论很多实验室的肝细胞直接分化方案中Wnt3a均作为分化培养基中的重要成分，并获得了形态和功能都较好的肝细胞或HLCs。

四、干细胞向肝细胞分化的3D培养

目前世界上多数实验室采用2D支持系统进行肝细胞的分化，大量研究表明2D培养亦能产生表达形态学、生物功能和肝细胞类似的细胞。但2D分化培养条件下诱导分化产生的细胞存在生存期较短、肝细胞功能低下等问题。此外，自然状态下肝脏是在三维的环境下生长，采用3D培养系统有利于提高细胞基质和因子之间的相互作用，稳定肝细胞的表型和功能。目前常用的3D培养生物材料一类是天然基质材料如胶原、透明质酸，但这类材料化学和物理特性不稳定，存在伦理和安全问题等。另一类是合成高分子聚合物如聚羟基乙酸、聚乳酸、聚氨酯等，这类材料大部分为生物材料，机械特性和物理特性差异较大，生物反应特性和可降解性也各不相同，在组成、结构等方面的设计更加灵活以适应不同的需要。可降解生物高分子能促进组织再生，这类材料能运输营养物质，进行物质代谢，有利于大分子的转运，因此能有效控制细胞接种的效率。Levenberg等[33]利用聚羟基乙酸和聚乳酸共聚合形成的可降解生物支架材料对hESC分化进行了研究,在activin A或胰岛素样生长因子1的诱导下hESC高表达甲胎蛋白和白蛋白。Hay等[34]通过微阵列实验挑选出6个最有利于肝细胞的分化的polymer，进而通过验证发现与2D的人工基质胶matrigel培养相比，高分子聚氨酯134（polyurethane 134）能提高肝脏功能基因表达、增强细胞的药物代谢能力。这些新的细胞分化培养材料的应用，为提供稳定产量的肝细胞奠定了基础。此外，研究者近年来对3D培养材料不断改进，采用了复合、修饰和改性的方法，如材料复合、对材料进行尺寸和形状特征修饰、在生物材料表面固定蛋白质或者多肽进行表面修饰等，以获得能支持肝细胞分化的良好生物材料。

其他新的3D培养材料和技术也陆续出现。Miki等[35]发现3D动力灌注系统诱导肝细胞分化，能显著改善代谢能力、肝脏特异性基因和蛋白表达、肝细胞功能。Schmelzer等[36]采用3D灌注培养体系亦发现，和常规的2D培养相比，分化所得的肝细胞特性更加稳定，能显著提高细胞色素氧化酶P450的表达，增加白蛋白的分泌和降低甲胎蛋白的水平。肝细胞的动态培养比静态培养有着更多优点，它能模拟肝脏循环保证氧气和营养物质的输送，在灌流系统中流体机械应力的存在能促进肝细胞球形聚集体的形成并重建与体内局部相似的微环境，因此能够提高肝细胞生存时间和改善肝细胞功能。

五、总结

PSCs能分化成稳定成熟的肝细胞，可用于细胞移植、生物人工肝等，近年来该领域发展较快，但肝细胞的体外分化始终是制约临床应用的重要因素。目前本实验室亦在从事PSCs向肝细胞分化的研究工作，具有较高的分化效率，分化所得的肝细胞能表达肝细胞相关基因和蛋白，但细胞活性和功能与人原代肝细胞相比依然有差距。因此如何提高干细胞向肝细胞的分化效率并获得高活性的肝细胞是包括笔者课题在内的很多干细胞研究工作者的焦点问题。在干细胞向肝细胞分化过程中，组织微环境起着极为重要的作用，体外培养过程中微环境的变化能使肝细胞丧失正常表型和肝特异性功能，合适的微环境能提高细胞分化的效率和改善细胞功能。因此改善细胞分化的微环境如改良分化培养基的配方，改善基质材料对细胞支持，采用动态培养方式，与其他细胞共同培养等，对高效获得有功能的肝细胞并利用其进行生物医学研究和临床应用具有重要意义。

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