牙本质基质蛋白-1及其相关蛋白矿化作用的研究进展*

占 柳 谢淑娟 潘卫红

牙本质基质蛋白-1(DMP-1)是在大鼠cDNA文库中检测到的酸性磷酸化细胞外基质蛋白，是矿化组织中非胶原蛋白的重要组成部分。DMP-1主要表达于牙齿，但近年来的研究发现其在骨组织、肾脏、胰腺等其它部位亦见表达，牙本质基质蛋白1不仅参与未分化间充质细胞向成牙本质细胞分化，还介导了牙本质的矿化和细胞间的信号转导[1]，但具体的机制尚未明确。

1. 牙本质基质蛋白-1的基因结构

DMP-1基因是首个被克隆的牙本质相关基因。到目前为止，人类已经成功克隆了大鼠、小鼠等多种动物及人的DMP-1基因全序列。DNA序列分析显示牙本质基质蛋白-1富含天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸，且其具有许多潜在的酪蛋白激酶Ⅰ和酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位点，同时具有一个潜在的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)细胞附着序列和一个经证实的N-糖基化一致序列。

大鼠DMP-1由489个氨基酸残基组成，其cDNA基因包含6个外显子和5个内含子，全长为13kb。第一个外显子长约95bp，编码5’端非翻译区的大部分区域；第二外显子长约19bp，编码5’端非翻译区，氨基酸残基的信号肽以及N末端的两个氨基酸；第3、4、5外显子分别编码16、11、15个氨基酸。其中第5外显子是由多个片段接合而成；第6外显子是牙本质基质蛋白-1的基因中最大的外显子，包含了80%的编码信息，约占cDNA全长的1/10，编码3’端非翻译区、终止码和与细胞黏附相关的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸细胞附着序列(RGD)三肽序列。外显子与内含子边界的确定，属于0类型，即外显子与内含子在边界合作中密切贴合，遵从经典的GT/AG规则。5个内含子的长度分别为3791bp、465bp、2047bp、162bp、1375bp，其编码的5个内含子中第一个内含子最大，对DMP-1在组织中的特异性表达起到重要的作用[2]；第4内含子最小。Pang Jl等[3]的研究初步确定了DMP-1上游启动子序列在成牙本质细胞分化中的调控作用及机制。在同源性方面，大鼠与人的基因序列的同一性为66.2%。另外，DMP-1基因还包含了SP1、AP1、GATA、CREB、C-Myc等基因的接合位点以及ELK1、ISRE等的血清反应元件[4-6]。

除DMP-1外，DMPS的家族成员还有DMP-2和DMP-3。DMP-2属于牙本质磷蛋白家族，富含丝氨酸和天门冬氨酸，是细胞外基质(ECM，extracellular matrix)生物矿化的初始调控蛋白。与DMP-2相比，DMP-3基因具有DSP基因编码序列，编码小型牙本质磷蛋白(minni-PP)。且DMP-2的两个功能域之间无终止码。

2. 核心结合因子及转录调控因子对牙本质基质蛋白-1的表达的影响

①核心结合因子-1(Cbfɑ1)对牙本质基质蛋白-1表达的影响

近年来的研究表明，Cbfɑ1的功能对骨形成领域的掌握和研究有重要的影响。Cbfɑ1表达于成骨细胞谱系的细胞中，并调节骨形成特异性基因的表达，同时它是成骨细胞和成牙本质细胞分化的关键。核心结合因子Cbfɑ1是成骨细胞分化的特异性转录因子，Cbfɑ1基因敲除实验表明Cbfɑ1在骨和牙的发育过程中起到至关重要的作用。在Cbfɑ1缺乏的动物中，同时发现骨发育不全或牙发育不全的症状。JQ.Feng[7]等通过体外凝胶电泳实验，Cbfɑ1瞬时转染结合无Cbfɑ1因子小鼠的体内研究，证实DMP-1是骨发育初始阶段软骨细胞和成骨细胞的标记基因，同时在软骨和骨发育的过程中，DMP-1是Cbfɑ1一个重要的目标分子，Pang Jl[3]等通过荧光素酶活力测试显示，在成牙本质细胞分化的过程中，Cbfɑ1正调节DMP-1的表达并对DMP-1瞬时表达形式产生影响。

在骨骼的发育过程中，Cbfɑ1与DMP-1的表达有时候会有所重叠，但 Cbfɑ1的表达早于DMP-1。JQ.Feng[7]等在研究 Cbfɑ1 和 DMP-1 的表达模式时发现，在小鼠胚胎发育的第12.5天，软骨形成；在胚胎发育的第14.5天，骨化开始；在胚胎发育的第16.5天，骨快速形成。在E12.5天并未发现DMP-1的表达，而Cbfɑ1在软骨组织中明显表达。在E14.5天，Cbfɑ1在软骨组织中继续高度表达，在此阶段，发育的骨中能够观察到DMP-1的表达，但仅限于含有肥大软骨细胞的区域。在E16.5天，DMP-1表达于肥厚的软骨细胞和成骨细胞中，与Cbfɑ1的表达相重叠。JQ.Feng通过对突变体小鼠的研究也证实了无Cbfɑ1突变体小鼠缺乏成熟的骨组织且牙齿发育不全。这说明Cbfɑ1是骨组织和牙齿发育过程中的一个重要的调节因子。Cbfɑ1转染表达媒介能够诱导C3H10T1/2细胞内DMP-1的表达，且与其剂量成正相关关系。说明Cbfɑ1功能性地调节了DMP-1的表达。

然而，在出生后小鼠骨的发育过程中，Cbfɑ1的表达与DMP-1的表达逐渐相脱离。在产后2周龄的动物体内，DMP-1在肥大的软骨细胞和骨细胞中高度表达，在产后8周龄的动物体内，DMP-1在骨细胞中高度表达，Cbfɑ1在软骨细胞和骨细胞中均未表达，却高度表达于成骨细胞中[7]，由此表明，Cbfɑ1与DMP-1在出生后小鼠骨的发育过程中，这种相关性已消失。

②转录调控因子c-Jun、c-Fos对牙本质基质蛋白-1的转录调控作用

DMP-1是在成牙本质细胞分化过程中能表达具有时空特异性的细胞外基质的酸性磷酸蛋白，虽然在动物试验中已经分离出DMP-1启动子，然而，转录调控因子是如何调控DMP-1启动子，我们知之甚少。

转录因子AP1(activator protein 1)家族可参与细胞增殖和分化，是骨组织和牙组织的特异性转录因子，这些转录因子的同位反应元素存在于DMP-1的启动因子中，结合MatInspector 软件分析结果，可推测c-Jun和c-Fos是通过结合人DMP-1启动子区的作用位点从而发挥对DMP-1的调控作用[8,9]。逄键梁[10]等的研究表明c-Jun和c-Fos可降低人DMPl基因转录活性，是HDPSCs向成牙本质细胞方向分化重要的调节因子，DMP-1启动子序列-110～-100bp区可能是c-Jun、c-Fos有效作用位点。

c-Jun和c-Fos是AP1超蛋白家族的主要成员，Narayanan K[11]等推测c-Jun和c-Fos可能参与牙本质细胞时空表达Dmp-1的调控过程。C-Jun的mRNA水平随着牙本质细胞的分化程度而增加，其在年轻和成熟的成牙本质细胞中均有表达，说明c-Jun参与牙胚中成牙本质细胞分化的转录调控过程，可作为成牙本质细胞的标志物。Hirata M[9]的研究发现，大鼠磨牙牙冠处临近牙本质矿化的成牙本质细胞中，有c-Fos的表达，其表达可能与成牙本质细胞中增强的骨钙素水平相关。总而言之，c-Jun和c-Fos在早期成牙本质细胞分化过程中发挥作用，而在中末期分化的成牙本质细胞中的作用并不明显。

3. 牙本质基质蛋白-1的功能

①DMP-1在牙本质矿化中的作用

目前，学者们并不确定牙本质基质蛋白-1的确切功能，Gajjeraman[12]等研究表明，大鼠重组DMP-1全基因及天然DMP-1C末端在Ⅰ型胶原的作用下均可加速羟磷灰石的成核作用，而DMP-1N末端则抑制其成核作用。由于DMP-1的组成中富含大量的丝氨酸，而丝氨酸多以磷酸化的形式存在，使得DMP-1成为等电点为3.68的强酸性蛋白，且磷酸化的氨基末端，可以与Ca2+结合。由此推测，DMP-1能够使羟磷灰石成核。在此过程中，DMP-1首先与Ca2+结合并启动矿物质沉积，随着成核的无定形钙磷沉淀物成熟，进而扩大融合，最终导致晶体形成[13,14]。另外，DMP-1基因的N末端氨基酸序列可以启动和稳定非平衡状态下的晶体以及核周围的微环境[15]。

DMP-1由成牙本质细胞合成分泌并在极化的牙本质细胞顶端表达，然后沿着细胞突分泌到矿化组织的前沿，像DMP-1这样的酸性蛋白质是成牙本质细胞矿化过程中重要的有机基质成分和参与核。成牙本质细胞的矿化是一个多步骤的复杂过程，精确地细胞介导机制参与调控这一过程。首先，组织形成细胞分泌结构性基质蛋白，这些结构性基质蛋白决定了组织的形状，并提供有序的、定向晶核形成和生长的空间。其次，组织形成细胞分泌一系列磷酸化的DMP-1，当晶核的形成和生长机制被启动，在不同的成核程序中，具有调控功能的酸性大分子DMP-1在特定的位点进入结构性基质中。正因为DMP-1结合钙离子和结构性基质的相互作用，最终调节晶体的生长、形态及矿化核的最终大小。

DMP-1除了具有Ca2+结合的能力，还具有高度的亲和力，可以和Ⅰ型胶原纤维结合，增加重建的Ⅰ型胶原纤维的直径[16]。另外，胶原蛋白中还含有少量的Ⅴ型胶原，经大量的研究证实，Ⅴ型胶原大分子形成原核后，Ⅰ型胶原交联到Ⅴ型胶原中，胶原纤维交织成网，从而为牙本质的矿化提供支架和空间。AtulSuresh Deshpande[17]等通过投射型电子显微镜观察发现磷酸化的DMP-1与非磷酸化的DMP-1的主要区别在于磷酸化的DMP-1诱导矿化部分成核，在此过程中无需胶原纤维的参与。

②DMP-1在骨组织形成和改建中的作用

DMP-1高度表达于胚胎发育过程中的成骨细胞。其表达与骨细胞核的形成与矿化密切相关，DMP-1存在于矿化早期的成骨细胞核内，在成骨细胞矿化的过程中，Jun-B和p300协同作用，能够显著地调控DMP-1的启动子的活性。p300内源性组蛋白乙酰转移酶活性在DMP-1表达调控中有着重要的作用[18]。Jun-B的Ser-79位置的磷酸化及Jun-B与p300之间的相互作用对成骨细胞的矿化同样十分重要。定性研究表明，机械负载对骨细胞中DMP-1的表达起到重要的调控作用，为了应对机械负载，骨细胞中的DMP-1被诱导表达，DMP-1 的氨基酸序列含有酸性结构域，携带负电荷，与携带正电荷的钙离子有很强的结合能力，因此能促进羟基磷灰石的形成并调控骨细胞的分化，在体内参与硬组织的矿化过程。在骨折愈合过程中，DMP-1通过对破骨细胞的黏附，从而激活破骨细胞，进而增强骨痂改建。

近年来，学者们对DMP-1的研究不断深入，DMP-1的基因结构、特异性表达极其矿化功能已经逐渐被认识。但是，DMP-1对成牙本质细胞分化和成熟的具体机制、如何调节牙本质和骨组织的形成等尚不明确，及其在修复性牙本质中的具体调控机制、对牙齿和骨组织矿化过程的调控作用尚不清楚。因此，对于DMP-1的探讨，在今后的研究中还有很多问题有待解决。

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