蛋白质组学在骨质疏松症大鼠颌骨组织差异蛋白筛选和鉴定中的应用*

李伯翰 刘洪臣 鄂玲玲

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是目前世界上发病率较高的疾病之一，世界卫生组织WHO已把OP列为中老年三大疾病之一。目前，我国OP患者约9000万，约占总人口的7.1%，随着社会老龄化的进程，其发病率呈上升趋势，预计到2050年将增加至2.21亿。OP可引起疼痛、骨骼变形、骨折等系列病发症状。骨质疏松时，颌骨骨密度下降，生物力学性能降低，致使牙周炎及牙槽嵴加速吸收，在种植牙方面，可降低种植体的骨结合率、延长种植体骨结合的时间，导致种植的失败。由于受牙、牙周和咀嚼习惯等因素等局部影响，颌骨骨质疏松骨质丧失有其自身的特点。因此，对OP大鼠颌骨组织蛋白表达的影响及相关机制的研究，有助于探寻颌骨骨质疏松的发病机理，检测相关的治疗方案，预测治疗效果。本文就蛋白质组学在骨质疏松症及骨质疏松症颌骨相关蛋白表达的研究进展作一综述。

1.颌骨骨质疏松实验动物模型的建立

建立OP实验动物模型是OP病因学与治疗学中不可缺少的研究平台。OP模型的选择应尽可能模拟临床人类OP的形成机制和特征，且要求观测指标稳定，重复性高。OP病理模型的方法很多，主要包括去势法、低钙饮食法、维甲酸法、糖皮质激素法、废用性骨质疏松法[1-3]。去势法是通过切除动物双侧卵巢造成雌激素的缺乏而形成骨质疏松，可以较好地模拟绝经后OP的骨代谢特点及临床症状。卵巢切除后，雌激素水平迅速下降，骨吸收大于骨形成，骨量减少，骨强度下降。而且作用因素单一、模型确认、重复性好，己成为标准化的绝经后OP经典病理模型，在研究中被广泛应用，也是美国FDA和WHO推荐的模拟妇女绝经后骨质疏松的最佳动物建模方法[2]。但去势法的造模时间相对长，而低钙饮食法恰恰可以缩短骨质疏松造模所需的时间。所以国内外学者，也常将去势法和低钙饮食法结合使用，成为OP常用的造模方法。

OP型常用动物有大鼠、家兔、山羊、狗、猴等[1-5]，其中大鼠在OP的实验研究中应用最为广泛。研究者在制备去势模型时，常选用3-6月龄大鼠[4]。此时的大鼠性成熟不久，虽然可较快地复制出OP模型，但由于基本生理条件仅能代表年轻机体，与临床绝经后骨质疏松的发病过程不尽吻合[6]而人类OP多在中年后期发生，故采用中老年大鼠可以复制出较为符合临床特征的动物模型[7]。关于造模后骨质疏松形成的时间，有研究报道[8]3月龄大鼠去卵巢后约50d，骨质疏松模型能够可靠形成。也有资料报道[9]雌性大鼠切除双侧卵巢后4周，骨密度、骨强度和骨钙含量才均明显低于空白对照组，因而认为4周后骨质疏松模型才形成。大鼠去卵巢4周后雌激素水平下降，促黄体素和促卵泡素水平上升[10]，骨代谢发生异常改变，破骨细胞骨吸收活动加速，骨转换率增高(骨吸收超过骨形成)，松质骨较皮质骨丢失更为严重，骨无机盐和有机质丢失增加，肠道钙吸收明显降低等变化，造成骨密度下降，骨组织形态学及超微结构遭到破坏[11]，导致骨生物力学性能的下降。

2.蛋白质组学技术

蛋白质组(proteome)是指由一个基因组、一种细胞或组织在某一特定时刻所表达的包括所有亚型和修饰的全套蛋白质。蛋白质组学(proteomics)就是以蛋白质组为研究对象，从整体角度分析研究细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平、修饰状态以及蛋白质之间的相互作用与联系，探索生命现象的本质和活动规律的科学[13-17]。蛋白质组学是21世纪生命科学的重要战略前沿，其三大支撑技术包括蛋白质的分离、鉴定分析及生物信息学，在研究过程中通过鉴定蛋白质组结构、功能及各蛋白质之间的相互作用关系，最终实现对蛋白质组表达模式和功能模式的研究。

蛋白质组学中分离技术是至关重要的一步，最早的蛋白质组学分离方法是蛋白质的双向电泳技术。其原理是根据蛋白在第一相中等电点的不同(使用固相pH梯度条即IPG)，在第二相中分子量的大小进行分离(使用传统的SDS－PAGE胶)，用不同的技术进行染色来显示这些蛋白质点[12]。质谱技术是指在蛋白质组学中，先用多相分离技术处理样品后，然后单个蛋白质点或破片通常被胰酶消化最终成为肽片段，然后依据它们的肽段质量指纹图谱用质谱分析去鉴定是何种蛋白。肽质量指纹图谱鉴定的数据库已经建立。把实验中经酶消化的肽段的肽质量指纹图谱输入数据库就能确定蛋白质氨基酸的序列[13-14]。与其他技术相比有几个明显的优点，如高分辨能力和直接检测蛋白质的翻译后调节; 但缺点在于，它的高通量分析能力较弱，而且对分离过酸过碱，分子量太大太小的蛋白比较困难。两个样品不同蛋白质的准确数据，对定量蛋白质组学提出了新的要求[15]。DIGE技术通过对蛋白质样品进行双向电泳前先用荧光进行标记然后将它们混合[16]。这种技术减少了胶内误差和假阳性率[17]，可以获得有重大生物学意义的可靠数据。液相色谱质谱法，不同的样品分析前先用不同的标签进行标记，如同位素标记亲和标签(ICAT)同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)[18]。其他体内代谢标记过程同样得到发展，如培养细胞时一个用重氨基酸链15N[19,20]进行标记培养，对照组用没有标记的轻链进行培养。蛋白质组学中的绝对蛋白质定量技术正尝试测量绝对蛋白质水平，通过引入特定蛋白质标志性肽段，提供一个详细的外部对照标准来对需要测量的蛋白指标进行测量[21]。

3.基于蛋质组学进行的OP相关研究

最新的蛋白质组学对骨质疏松的研究重点集中在破骨细胞和成骨细胞的分化及其功能。应用蛋白质组学技术研究骨质疏松症取得了许多可喜的进展。例如发现了与成骨细胞分化有关的新蛋白质。杨军[22]通过比较不同组间股骨蛋白质分子以及图谱，找到了相对应的差异蛋白质，根据它们质和量的不同，分别命名为Creatine kinase M-type、Serotransferrin、Fructose-bisphosphate aldolase A。Salasznyk[23]用蛋白质组学比较了人成骨细胞和人骨髓基质细胞之间的蛋白表达差异[23]，这个研究集中于鉴定潜在的成骨标记，结果显示有737个不同的蛋白点。其中有257个(34%)点的在两种细胞中都表达，剩下的480个点中有312(65%)证明仅在成骨细胞中表达。这个发现表明在成熟的成骨细胞和那些未分化的骨髓基质细胞的蛋白质组有着显著差异。

Lee[24]应用蛋白质组学技术研究雌激素缺乏在大鼠骨蛋白质表达中的作用，经双向凝胶电泳、质谱和大鼠蛋白数据库成功鉴定出3种明显变化的蛋白质，即硫氧还蛋白过氧化酶-1、阻凝蛋白轻链肤-2和泛素化酶E2-17kD，王海彬[25]等在此研究基础上，发现其中泛素化酶E2-17kD为雌激素相关蛋白，其余两种则首次报道为骨质疏松相关蛋白；同时在实验中设立中药治疗组，初步认为这3种蛋白质在绝经后骨质疏松症发病及中药治疗过程中发挥着重要的调控作用。这些结果为阐明雌激素丢失相关骨质疏松症的分子机制，提供了实验依据。总之，用定量蛋白质组学研究骨质疏松还是一个新兴领域，但是它将骨质疏松的诊断和治疗带入一个全新的时代。

4.颌骨组织中OP相关蛋白

4.1 OP与颌骨的关系

多数学者的研究认为，OP的部位差异性很大，颌骨与骨质疏松间存在着一定的关系[25,26]。颌骨包绕牙齿部分的牙槽骨，作为全身骨代谢最活跃的部位，与全身骨质疏松状态具有高度的相关性，是最容易出现骨质疏松的部位之一[27]。Binte Anwar等[28]研究去卵巢的猴，将其牙槽骨的微结构与腰椎骨矿物密度比较，发现去卵巢组的颌骨矿物密度较对照组明显减低，第二磨牙的根间间隔区的骨小梁数、皮质骨厚度均减少，间隔区骨也更多孔，由此得出结论：在这些猴中，雌激素的缺乏导致了磨牙区牙槽骨小梁结构更脆弱。Jonasson等[29]研究表明，第一双尖牙区牙槽骨厚度与前臂远中端骨密度密切相关，同时还发现尖牙与侧切牙间牙槽突厚度亦与前臂远中端骨密度密切相关，因而认为下颌骨骨密度可用于推测全身骨质疏松状态。Hirai等[30]的研究表明，OP的严重程度与剩余牙槽嵴高度呈负相关；同时剩余牙槽嵴的高度有明显的性别差异，女性显著低于男性，这与妇女绝经后OP有关。王铁梅等[31]通过计算机处理软件对口腔牙周健康的40例老年性OP患者和80例健康对照组研究表明，颌骨骨密度与全身骨密度有一定的相关性。因此，大多数学者认为，全身性骨质疏松与颌骨的骨矿丢失之间呈正相关，骨质疏松与下颌骨的萎缩及牙槽骨吸收有显著的相关性，绝经后女性体内雌激素水平降低，可导致牙槽骨骨质丢失。

4.2 颌骨OP相关基因

寻找OP相关组织蛋白的研究在过去20年已广泛进行，这些研究基本上着重于以下几个方面①寻找正常和病变组织中蛋白表达的差异，②研究不同的内源性的调节因子(如激素、受体)的效果。③在药物治疗骨质疏松的过程中蛋白表达的变化等等。

OP是由于骨形成障碍以及成骨细胞和破骨细胞活性的不平衡而引起的，最近的蛋白质组学研究主要集中在这些细胞的分化和它们的功能研究上。来源于具有向多向分化潜能的骨髓基质细胞(BMSC)的成骨细胞，可以合成骨基质，而来源于单核细胞的破骨细胞可以吸收骨[32]。吴璇等[33]研究证实糖尿病骨质疏松症大鼠颌骨成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)以及成骨相关基因Runx2表达异常。

虽然蛋白质组学技术在OP的应用越来越广泛，研究技术不断进步并取得了一些成绩，但是该技术对OP颌骨组织蛋白这一领域的应用目前还处于起步的阶段，目前已经发现并鉴定了高表达的颌骨骨质疏松症相关蛋白为数不多，其中一些如COMP、Coll2、MMPs先前的对骨关节炎疾病中就已经被发现，最近再次被蛋白质组学证实是颌骨OP的生物标志物[34]。Kawase等[35]从健康志愿者的牙槽骨获取骨膜组织，检测诱导成骨过程中蛋白质的表达，发现在成骨分化过程中，除了IL-6、ANG、LIF等已道的因子上调外，HSP-27的表达也明显增加。但是，诱导成骨分化的机制目前仍不清楚，吴璇[36]发现葡萄糖转运蛋白-1及胰岛素受体α1的在糖尿病骨质疏松大鼠下颌骨成骨细胞中高表达。

随着21世纪生物技术的进步和纳米技术的兴起，蛋白质组学技术将日臻完善，自动化、高通量和高灵敏度等优点将使其在骨质疏松症颌骨蛋白筛选，发生机制，骨质疏松症后组织修复再生工程以及生物靶向治疗和药物研发等研究领域中具有广阔的应用前景。

5.小结

以上研究结果表明全身骨质疏松与颌骨骨质丢失具有密切的相关性,人口老龄化的增高，人类对于OP和颌骨骨量丧失的相关研究将会进一步深化，近年来新发展起来的蛋白质组学改变了传统基因和蛋白质检测技术的局限性，具有全面性、高通量及大规模等优点，可以从整体、动态和探索的角度对一个组织或细胞的基因组及其表达的全部蛋白质进行研究，深入地探索骨质疏松对颌骨骨丢失病理生理活动规律。蛋白质组学及相关实验技术的飞速发展，为骨质疏松颌骨病变的研究提供了全新的视野和更为广阔的技术平台。

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