microRNAs在结直肠癌中的研究进展

杨宝峰

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤，在西方发达国家，结直肠癌发病率居第3位[1]。在我国，结肠癌发病率占第4位且其发病率和致死率逐年增加[2]。结直肠癌转移率高、早期诊断率低、手术切除后易复发是造成结直肠癌致死率高的主要因素。研究发现，microRNAs(miRNAs)参与促进结直肠癌细胞增殖抑制结直肠癌细胞凋亡及促进转移等过程。因此，本文旨在探讨miRNAs在结直肠癌发生发展中的作用，探讨能否成为结直肠癌早期诊断标志物及治疗靶点，以提高结直肠癌诊治水平。

一、miRNAs的生成及其作用机制

miRNAs是一类由18～25个核苷酸构成的内源性非编码微小RNA,在进化中高度保守。首先，编码miRNA的基因在细胞核内转录成300～1000个碱基长度并具有发夹结构的pri-miRNA。然后，pri-miRNA在细胞核内经核糖核酸酶Drosha剪切产生70～90个碱基长度并具有颈环结构的pre-miRNA。接着，pre-miRNA由转运蛋白-5(Exportin-5)转运至胞浆，经过Dicer酶剪切后形成18～25个核苷酸的成熟双链miRNAs。最后，在解螺旋酶的作用下，成熟miRNAs解离，其功能链通过与Argonaute蛋白结合形成RNA诱导的默复合物[3]。

成熟的miRNAs通过与靶基因mRNA3’-UTR端完全或不完全互补结合，进而降解靶基因mRNA或抑制其翻译。自从1993年在线虫中发现第一个miRNA以来，越来越多的研究证实miRNAs在生物体中发挥着重要作用。miRNAs具有调控细胞增殖、分化、凋亡、代谢等基本生命活动的功能。研究表明miRNAs同样参与了多种肿瘤的发生与发展过程，例如结直肠癌、胃癌、肝癌等[4]。

二、miRNAs在结直肠癌中的作用机制

Robert A.Weinberg提出癌症细胞具有十大特征(图 1)，包括自给自足生长信号(self-sufficiency in growth signals)、抗生长信号的不敏感(insensitivity to antigrowth signals)、抵抗细胞死亡(resisting cell death)、无限复制的潜能(limitless replicative potential)、持续的血管生成(sustained angiogenesis)、组织浸润和转移(tissue invasion and metastasis)、避免免疫摧毁(avoiding immune destruction)、促进肿瘤的炎症(tumor promotion inflammation)、细胞能量异常(deregulating cellular energetics)基因组不稳定和突变(genome instability and mutation)[5]。miRNAs在结直肠癌细胞获得这些特征功能的过程中发挥重要作用[6]。

1.细胞增殖：细胞获得自给自足的生长信号或者对抗生长信号的不敏感，均可导致癌细胞异常增殖并癌变。Ras/MAPK信号通路的异常激活，可以促进结直肠上皮细胞增殖，进而导致结直肠癌的发生。癌基因KRAS是Ras/MAPK信号通路的核心基因，受多个miRNAs调节。例如，KRAS是let-7a的靶点，结直肠癌患者中let-7a表达降低，且KRAS表达升高；将let-7a转染入体外培养的人结肠癌细胞中，可以降低KRAS蛋白表达量，并显著抑制癌细胞生长[7]。又如，结直肠癌患者中miRNA-143表达量降低，其靶基因KRAS上调并促进癌细胞增殖[8]。其他参与细胞增殖过程的通路亦受miRNA调节。例如，miRNA-34a发挥抑癌作用，在结直肠癌中通过调节E2F信号通路抑制癌细胞过度增殖[9]。miRNA-137通过靶向Cdc42阻滞细胞周期，从而抑制癌细胞增殖[10]。此外，miRNA-145、miRNA-30a-5p和miRNA-320a在结直肠癌中均发挥抑癌作用，可抑制结肠癌细胞增殖[11-13]。然而，miRNA-95和miRNA-17在结直肠癌中发挥促癌作用，可以促进癌细胞的增殖[14-15]。

2.细胞凋亡：组织内环境的稳态主要依赖于体内细胞增殖和细胞死亡之间的相互平衡，在肿瘤细胞中，两者之间的平衡被打破。因此，抵抗细胞凋亡是肿瘤的另外一个重要特征，在结直肠癌的发生中发挥着重要作用。

经典的细胞凋亡途径分为内源性和外源性凋亡通路，Bcl-2蛋白家族在内源性凋亡信号通路中发挥着重要作用。近年研究发现许多调控Bcl-2家族的重要miRNAs(如miRNA-365，miRNA-491和miRNA-148)。在结直肠癌患者中miRNA-365表达量降低，进而上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量，最终抑制结直肠癌细胞凋亡[16]。在结直肠癌患者中，miRNA-491和miRNA-148分别下调抗凋亡基因Bcl-xL和Bcl-2表达量而促进细胞凋亡[17-18]。Geng等[19]发现let-7可通过下调Fas表达量而抑制死亡受体介导的外源性凋亡通路，进而抑制结肠癌细胞的凋亡。此外，miRNA-34a、miRNA-26、miRNA-342等在结直肠癌细胞凋亡过程中也发挥着重要的调节作用[20-21]。

3.癌细胞转移：癌细胞发生转移是癌症的关键特征。大量研究表明，miRNAs参与结直肠癌细胞转移过程。转录因子ZEB1可通过抑制E-adherin的表达促进肿瘤细胞转移。Chen等[22]发现iRNA-200c靶向调控ZEB1,并与ZEB1相互抑制,形成负反馈环调节结直肠癌细胞的侵袭转移能力。神经纤毛蛋白1(neuropilin-1，NRP1)可通过依赖于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和独立于VEGF两种途径参与肿瘤血管新生，在肿瘤转移过程中发挥作用，Wernicke等[23]发现miRNA-320a通过调节NRP1表达量在结直肠癌转移中发挥重要调节作用。此外，miRNA-21与miRNA-499-5p均可作用于抑癌基因PDCD4而促结直肠癌细胞转移[24-25]。let-7c、miRNA-145等miRNAs在结直肠癌的转移过程发挥核心作用[26-27]。

4.其他作用：除了调控细胞增殖、细胞凋亡和转移外，miRNAs还参与调节结直肠癌的其他特征(图1)。例如，癌症细胞的持续生长必须依赖新生血管供应营养，研究证实miRNA-29b可以通过抑制血管新生而抑制结直肠癌的发生，而miRNA-194水平的降低可促进血管新生进而诱导结直肠癌的发生和转移[28-29]。此外，癌基因组呈现不稳定性、伴随大量突变、炎症的发生以及逃避免疫监视等特征，miRNAs亦参与了这些过程的发生。miRNA-155可以促进癌细胞的基因突变，使癌基因组稳定性降低[30]。在结直肠癌中，miRNA-21和miRNA-181b-1分别作用于PTEN用于第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen,PTEN)和肿瘤抑癌基因(cylindromatosis,CYLD)进而激活NF-kB，促进炎症的发生[31]。miRNA-328可通过调节肿瘤干细胞而参与结直肠癌的病程[32]。

三、miRNAs与耐药性

目前，肿瘤细胞耐药性是临床肿瘤化疗失败的重要原因之一。因此，研究肿瘤细胞耐药性机制，逆转肿瘤细胞耐药性，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，具有重要的临床意义。已有研究显示多个miRNAs参与调控肿瘤细胞的耐药性，miRNA-143可以增加结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性，而miRNA-19b水平的升高可以使结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶产生耐药性[33]。miRNA-192和miRNA-215可以使结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶产生耐药性，同时miRNA-215可降低结直肠癌细胞对氨甲喋呤和雷替曲塞的化疗敏感性[34]。其他miRNAs，如miRNA-21、miRNA-506等，也参与调节结直肠癌细胞耐药性[35-36]。

四、miRNAs作为结肠癌早期诊断和预后标物

结直肠癌起病隐匿，病死率高，治疗结直肠癌的关键在于早期诊断，早期治疗。目前，癌胚抗原(cancer embryo antigen,CEA)是临床上惟一一个用于结直肠癌患者诊断及预后的分子标志物，但其效果不佳，因此迫切需要发现新的结直肠癌诊断标志物。

研究表明，血浆中的循环miRNAs可以作为诊断结直肠癌的早期标志物。Ng等[37]发现结直肠癌患者血浆中miRNA-17-3p和miRNA-92a表达水平显著升高，而通过手术切除癌组织后，患者血浆中的miRNA-17-3p和miRNA-92a又可恢复到正常水平。此外，miRNA-92a还可作为区分结直肠癌、胃癌和肠道炎症疾病的分子。除了外周血，粪便中的miRNAs也可以作为诊断结直肠癌的标志物。Link等[38]发现结肠直肠癌患者粪便中的miRNA-21和miRNA-106a显著升高。

通过研究miRNAs的异常表达与结直肠癌患者预后之间的关系，研究人员发现miRNA-21的高表达与晚期肿瘤的淋巴结转移有关，miRNA-21高表达的结直肠癌患者术后无病生存时间缩短，预后差。因此，miRNA-21的表达量与结直肠癌转移及临床预后等相关[39]。除了miRNA-21外，miRNA-372、miRNA-143、miRNA-125b等均可作为评价结直肠癌患者预后的标志物[40-42]。越来越多的miRNAs被发现可以作为结直肠癌早期诊断和预后评价的标志物，但是如何开发经济有效、简单快捷的诊断试剂盒还需要科研工作者进一步探索。

五、miRNAs与治疗

研究发现，多种miRNAs在结直肠癌患者异常表达，参与癌症发生与发展过程。因此，人们设想恢复异常表达的miRNAs是否可以治疗结直肠癌。miRNA-92在结直肠癌中表达量升高，Tsuchida等[43]运用胆固醇连接的反义核苷酸anti-miRNA-92将miRNA-92沉默，发现可以引起结肠癌细胞凋亡，提示miRNA-92可作为治疗结肠癌的潜在靶点。Ibrehim等[44]用聚乙烯亚胺介导未经修饰的miRNA-145拟似物，将其注入到患有结肠癌的小鼠体内，发现miRNA-145可以抑制其靶基因c-Myc和ERK5的蛋白表达量，抑制肿瘤细胞增殖同时可引起细胞凋亡，最终抑制肿瘤生长。用同样的研究方法发现miRNA-33a亦可以发挥抗肿瘤作用，可作为治疗结直肠癌的潜在治疗手段。

人们试图将miRNAs开发成治疗结直肠癌的核酸药物，或者以异常表达的miRNAs为靶点，开发可以特异性调节这些miRNAs的药物，为结直肠癌患者的预防和治疗带来新的希望。然而，miRNAs用于临床治疗还存在一些问题，一个miRNA可调节多个靶基因，如何确保作为治疗分子的miRNAs可以准确地运送到效应细胞作用于相应靶点，以及miRNAs在体内的稳定性和安全性等都是miRNAs用于癌症治疗中遇到的技术壁垒。

六、展望

结直肠癌早期诊断不明确，转移率高，预后差，死亡率高。研究发现，miRNAs参与结直肠癌的发生与发展、预后及产生耐药性的过程，miRNAs可以作为促癌或抑癌分子调控结直肠癌，同时也可以作为诊断和预后的标志物，丰富了我们对结直肠癌发病机制的认识，为提高其诊断率和治疗率提供了新的思路。

目前，关于miRNAs在结直肠癌治疗中作用的研究还处于探索阶段，大部分的试验主要集中于细胞试验或者动物试验，要将其应用于临床诊断或治疗还需要进一步的系统研究。另外，miRNAs在致癌过程中并不是孤立的发挥作用，miRNA与miRNA，miRNAs与转录因子之间存在相互调节作用，一个miRNA可以调节多个信号通路，一个信号通路又可受多个miRNAs调节。随着miRNAs认识的不断深入，需要绘制miRNAs在结直肠癌发生与发展过程中发挥作用的网络图谱，进而更好地揭示miRNAs在结直肠癌中的调控机制。

(本文图1见光盘)

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