大鼠百草枯中毒肺内炎症因子表达﹡

西安交通大学医学院第二附属医院急诊科（西安710004） 王小闯 高 欣 古长维 党晓燕

大鼠百草枯中毒肺内炎症因子表达﹡

西安交通大学医学院第二附属医院急诊科（西安710004） 王小闯 高 欣△古长维 党晓燕

目的：测量百草枯中毒后大鼠血清中炎症因子的水平。方法：将96只大鼠随机分为阴性对照组、高剂量染毒组 （120mg／kg）、中剂量染毒组（60mg／kg）和低剂量染毒组（30mg／kg），每组24只大鼠。实验分8、24、72h三个时间段进行观察。应用酶联免疫吸附法（ELISA）测量血清TGF－β1、TNF－a、IL－10浓度。将大鼠肺进行病理切片及 Masson染色观察肺纤维化情况。结果：随染毒时间延长，各剂量组细胞因子水平逐渐增加，24、72h组与对照组比较均有显著性差异（P＜0.05）。72h高剂量组各指标与同时间点低剂量组比较均有显著性差异（P＜0.05）。72h高、中、低3个剂量组与8h时间点比较有显著性差异（P＜0.05）。大鼠肺组织中出现炎性粒细胞浸润，广泛弥漫的间质纤维化表现。Masson染色，24h后肺组织中分泌纤细的胶原纤维，72h后可见到大量蓝染的胶原纤维。结论：大鼠百草枯中毒后TGF－β1、TNF－a、IL－10等炎症因子水平显著升高。

百草枯是广泛使用的有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂，易溶于水，微溶于酒精，可被碱水解，惰性黏土和阴离子表面活性能使其钝化。百草枯与血浆蛋白结合很少，且不经代谢，在肾小管中不被重吸收，以原形从肾脏排出，但其能够被肺选择性摄入。百草枯对人畜有较强毒性，如经皮肤接触、呼吸道吸人及误服均可造成急性中毒。百草枯不仅可以引起肺纤维化，还可以导致MODS，不论是肺纤维化或是MODS均有炎症因子参与其中，本实验就其炎症因子的表达进行了相关研究。

材料与方法

1 动物与分组 成年健康Wistar大鼠（由西安交通大学医学院实验动物中心提供）96只，雌雄各半，体重250g±30g 随机分为对照组、高剂量染毒组（120mg／kg）、中剂量染毒组（60mg／kg）和低剂量染毒组（30mg／kg）四组，每组24只大鼠。

2 实验与观察 染毒组给予相应剂量的百草枯溶液lml灌胃，并对阴性对照组同时给予1ml蒸馏水。每组按染毒后时间又分为8h、24h、72h三个亚组。染毒前及染毒后给予大鼠正常饲料及饮水。分别于8、24、72h时间段对各组实验动物的大体变化进行观察，各组动物均于观察结束后采用下腔静脉穿刺取血约5ml，静置20min，离心后取血清，－70℃冻存，待检测，抽血后处死大鼠，大鼠处死后，立即解剖取肺组织进行病理实验。

3 血清 TGF－β1、TNF－a、IL－10浓度测定 TGF－

β1、TNF－a、IL－10试剂盒由美国 R＆D公司进口分装，上海森雄科技实业有限公司提供；血清TGF－β1、TNF－a、IL－10浓度采用酶联免疫吸附法（ELISA）进行测定，按试剂盒有关说明进行操作。

4 统计学处理 本组所有实验数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，各参数以均值±标准差（x±s 表示。经正态性检验与方差齐性检验，满足正态性与方差齐性的数据作完全随机设计的方差分析，以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

1 动物大体变化 染毒大鼠于染毒后不同时间出现烦躁、易激惹、少动、萎靡、厌食、毛蓬松、呼吸急促表现，各剂量组8、24h无动物死亡，高剂量组72h有2只动物死于呼吸衰竭。

2 细胞因子变化 见附表及图1～4。随染毒时间的延长，各剂量组细胞因子水平逐渐增加，染毒后24、72h与8h各组比较，均有显著性差异（P＜0.05）；72h高剂量组各指标与同时间点低剂量组比较也有显著性差异（P＜0.05）；72h高、中、低3个剂量组与对照组相同时间点比较有显著性差异（P＜0.05）。提示随染毒浓度的增加细胞因子水平逐渐增加，随时间的延长细胞因子的水平也逐渐增加，存在有一定的线性趋势，在整个试验过程中表现出动态的变化。

附表 各组大鼠血清炎症因子含量（±s）

附表 各组大鼠血清炎症因子含量（±s）

注：＊细胞因子含量与8h组比较明显改变（P＜0.05）；△细胞因子含量与同时间点低剂量组比较明显改变（P＜0.05）；＃细胞因子含量与对照组比较明显改变（P＜0.05）

组 别 监测指标 染毒后8h 染毒后24h 染毒后72h对照组 TGF－β1 67.49±21.53 64.93±23.68 62.50±25.71 TNF－α 34.73±6.31 32.93±6.13 38.46±6.74 IL－10 21.95±4.18 24.25±4.57 23.55±4.15低剂量组 TGF－β1 397.54±94.38 443.46±114.98＊ 954.83±189.25＊＃TNF－α 35.39±6.22 42.64±9.20＊ 49.28±10.32＊＃IL－10 23.03±5.23 30.33±6.42＊ 48.42±8.34＊＃中剂量组 TGF－β1 498.35±185.39 927.42±158.39＊ 1278.84±289.35＊＃TNF－α 36.82±7.24 49.68±9.35＊ 74.22±13.84＊＃IL－10 24.20±5.23 36.80±8.92＊ 58.25±10.17＊＃高剂量组 TGF－β1 623.20±189.35△ 1053.97±298.58＊△ 1387.98±395.38＊△＃TNF－α 41.05±9.24△ 52.20±14.63＊△ 92.38±13.12＊△＃IL－10 28.39±5.35△ 29.85±8.53＊△ 40.28±10.48＊△＃

3 病理改变 肉眼观察，PQ染毒后自8h起，肺即出现肿胀，颜色变为暗红，肺脏重量随着中毒时间的延长，逐渐加重；并且伴有弥漫性出血，部分大鼠甚至有满肺肿胀出血。HE染色切片观察，染毒后8h出现肺泡毛细血管的扩张充血，内皮细胞肿胀，继而出现以中性白细胞为主的炎细胞浸润，肺泡腔内充血有蛋白水肿液的渗出；染毒后24h肺泡毛细血管扩张更加明显，有大量渗出液及炎性粒细胞的浸润，同时肺泡腔内渗出液开始机化；染毒后72h渗出更加广泛和弥漫，出现广泛弥漫的间质纤维化的表现。

讨 论

特发性肺纤维化的形成与众多细胞因子有关［1，2］。由淋巴细胞和巨噬细胞产生的活化的成纤维细胞刺激因子在百草枯诱导的肺间质纤维化形成过程中起重要作用，从活化脾细胞培养的刀豆素中提取的含有丰富淋巴因子的上清液，可明显抑制百草枯诱导的肺纤维化及伴发的炎症反应。给鼠灌入百草枯（30mg kg后12h，肺泡灌洗液中白三烯B4（LTB4）明显升高，而在百草枯灌人后8h再给予N－乙酞半胧氨酸（50mg／kg）则抑制LTB4升高。有关细胞因子与特发性肺纤维化关系研究较多，但百草枯诱导的肺间质纤维化与细胞因子的关系国内外报道较少。

在肺损伤的早期巨噬细胞分泌TGF－βl，可刺激成纤维细胞增殖和分化。随着肺纤维化的进展，成纤维细胞以自分泌的方式产生 TGF－βl，所分泌的 TGF－βl以旁分泌的方式与肺间质相互作用，促使间充质干细胞增殖和分泌细胞外基质［3］。

近年来有文献提出并解释肺纤维化细胞因子网络的概念，产生细胞因子的细胞有肺巨噬细胞（肺泡型细胞、中性粒细胞、上皮细胞和毛细血管内皮细胞等。在肺损伤时，M 小来源的细胞因子有IL－10、TNF－α［4］，这些细胞生长因子一方面使炎症细胞浸润，分化和成熟；另一方面促进细胞因子和炎症递质的进一步分泌和表达，形成复杂的细胞因子网络，引起肺泡炎和肺损伤。IL－lp的生物活性与TNF－α十分相似，对巨噬细胞及中性粒细胞有趋化和豁附作用，可增强血管通透性，并促进TNF－α所导致的组织损伤。IL－10主要由Th Z细胞产生，也可由单核／巨噬细胞产生，其主要的生物学特性是抑制IL－2、干扰素（IFN）－Y、TGF－α产生，能调节T细胞的功能，促进细胞毒性T淋巴细胞诱导、增强B细胞的增殖和分比，IL－10可减轻炎症反应，减少胶原的产生，有助于控制炎症，维持机体的稳态，是损伤的一种代偿反应。本次研究结果表明，百草枯染毒后，大鼠血清中细胞因子TNF－α、IL－10水平明显增加，随染毒时间的延长其表达水平也增加，存在有一定的线性趋势，在整个试验过程中表现出动态的变化，说明在百草枯染毒的大鼠模型中，TGF－β1IL－10 TNF－α细胞因子的水平与肺纤维化的发生可能密切相关，并形成了复杂的细胞因子网络，调控肺泡上皮细胞和间质成纤维细胞的增殖和凋亡，使细胞外基质的积逐渐增多，抑制纤溶系统的激活，最终促使肺纤维化的形成［5］。

总之，本研究提示在百草枯中毒发病过程中，细胞因子 TGF－β1、IL－10、TNF－α表现明显的剂量依赖，随着染毒浓度的增加，细胞因子表达的改变出现变化，并随着时间的改变呈改变，然而其作用的具体机制尚需进一步研究。

［1］ Ortiz L A，Lasky J，Hamilton R F，et al.Expression of TNF and the necessity of TNF receptors in bleomycin－induced lung injury in mice［J］.Exp Lung Res，1998，24（6）：721－743.

［2］ 韦小瑜.细胞因子与肺纤维化 ［J］.西南军医，2006，8（2）：54－57.

［3］ Ruiz V，Ordonez RM，Berumen J，et al.Unbalanced collagenases／TIMP－1 expression and epithelial apoptosis in experimental lung fibrosis［J］.Am J Physiol，2003，285（5）：1026－1036.

［4］ Song M，He B，Qiu Z.Expressions of TNF alpha，PDGF in alveolar type II epithelial cells of rats with bleomycin－induced pulmonary fibrosis［J］.Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，1998，21（4）：221－223.

［5］ AIai T，Abe K，Matsuoka H，et al.Introduction of the Interleukin－10gene into mice inhibited bleomycin－induced lung injury in vivo ［J］.Am J Physiol Long Cell Mol Physiol，2000，278（5）：914－922 .

The expression of pulmonary inflammatory factor in paraquat poisoning rats

Department of Emergency，the Second Affiliated Hospital of Medical College，Xi’an Jiaotong University（Xi’an 710004） Wang Xiaochuang Gao Xin Gu Changwei et al

Objective：To measure serum levels of inflammatory factors in paraquat poisoned rats.Methods：96 rats were grouped in accordance with the randomly principle.They were divided into control group and high dose exposure group（120mg／kg），middle dose exposure group（60mg／kg）and low－dose exposure group（30mg／kg），n＝24 rats.Experimental were divided into8，24，72 h points for observation.Used enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）measurement to measure serum TGF－β1，TNF－a，IL－10 concentration.The rats lung were used biopsy and Masson staining to observe pulmonary fibrosis.Results：With the exposure time，each dose group the levels of cytokines gradually increased.24，72 h compared with the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.The every target in 72h high dose group with the same point compared with lowdose group was significantly（P ＜0.05）.72h high，medium and low－dose group compared with the 8h time group was statistically significant（P ＜0.05）.Rat lung tissue infiltration appears inflammatory granulocytes，extensive diffuse interstitial fibrosis of the performance.Conclusion：In paraquat poisoned rats，theinflammatory cytokine of TGF－β1，TNF－a，IL－10 levels were significantly increased.

Poisoning／physiopathology Chemokines／metabolism Animals，laboratory Rats

中毒／病理生理学 炎症趋化因子类／代谢 动物，实验 大鼠

R595.4

A

1000－7377（2012）09－1107－03

﹡ 陕西省科学技术研究发展计划项目（No 2012k16－01－03）

△ 陕西省人民政府机关门诊部

（收稿：2012－03－20）