高效液相色谱法测定武夷橙中的有机酸

（武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300）

前言

武夷橙是继“武夷岩茶”之后又一个以“武夷”命名的名果，它是经科技人员辛勤培育的，适宜武夷山种植的一种新橙种。武夷橙含橙皮甙、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、果糖、果胶和大量维生素（C、P）等营养物，增加毛细血管的弹性，其中以柠檬酸含量最高，柠檬酸具有显著的保健效果，它不仅能有效促进体内乳酸分解，解除疲劳，改善精神状态，而且能增进食欲，保护肝脏和肾脏，具有防治疾病和延缓衰老等诸多功效。

有机酸测定的传统化学法容易受干扰、误差大、且每次只能测定一种有机酸。薄层色谱法定量精度差；气相色谱法往往需要衍生步骤，不仅烦琐、而且影响分析结果。高效液相色谱测定方法简便，特别是对于芳香族有机酸和多元酸，已被广泛用于各种食品及天然物中有机酸的测定[1-3]。本实验研究采用反相高效液相色谱法，对武夷橙中多种有机酸进行分析测定，取得较好的结果。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

高压液相色谱系统（HPLC）是由Hitachi L-2000输液泵，Hitachi L-2400紫外检测器，Rheodyne 7725六通阀进样器，T2000色谱工作站组成；KQ-250DB型数控超声波清洗器；组织粉碎机；800型低速离心机；SHB-Ⅲ型循环水真空抽滤机；W201B恒温水浴锅；S2-Ⅱ型自动双重纯水蒸馏器。

标准品草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、乙酸和琥珀酸均为分析纯；样品为刚采摘下的武夷橙；磷酸二氢铵，无水乙醇和磷酸都为分析纯；水是三次重蒸水。

1.2 样品萃取

将新鲜武夷橙清洗后去皮，放入组织粉碎机中粉碎，出汁。取5g橙汁在水浴75℃下蒸干后，加入80%的无水乙醇5mL，使底物完全溶解，然后在7200r/min下离心15min，取上清液再次蒸干后，加入2.5%磷酸二氢铵5mL溶解，再次离心15min，最后用磷酸二氢铵定容至10mL，真空抽滤后完成样品萃取。

1.3 标准溶液配制

准确称取草酸5mg、酒石酸50mg、苹果酸150mg、乳酸200mg、柠檬酸120mg、乙酸200mg及琥珀酸180mg标准品，用三次蒸馏水配制成一系列浓度为0.1、1、3、4、2.4、4、3.6mg/ml的标准有机酸混合溶液。

1.4 色谱分离条件

色谱柱：C18 柱（150mm×4.6mm i.d.,5μm）；流动相：2.5%磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节pH为2.5），使用前经0.45μm滤膜减压过滤；流速：1 mL/min；检测波长：210nm；标准及样品用前均经0.45μm滤膜过滤。

1.5 分析测定方法

分别取有机酸标准混合液 1，2，4，6，8，10μL 进样进行色谱分析，得出有机酸标准溶液色谱图。以各有机酸的峰面积为纵坐标，有机酸的含量(μg)横坐标分别绘制各有机酸的标准曲线，用最小二乘法原理建立各有机酸的回归方程。

2 结果与讨论

2.1 流动相选择

有机酸为弱酸，在水系流动相中易解离，故采用离子抑制方法，使其在非极性固定相上保留而得到分离。有机酸的紫外吸收大多在210 mm左右，磷酸二氢铵缓冲溶液在紫外区几乎无吸收，作为测定有机酸的流动相可改善有机酸的分离而不影响检测。本实验采用2.5%磷酸二氢铵缓冲溶液作为流动相。

2.2 缓冲溶液PH值确定

因为有机酸在水中以RCOOH和RCOO-两种形式存在,PH值越小，酸以RCOOH形式存在。如果用RP-HPLC对有机酸分析时，希望被分析的物质在流动相中以RCOOH形式存在，并要求半峰宽小，峰形对称，分离效果好。可以通过调节流动相的PH值来实现，但不能低于普通反相色谱柱可耐受的PH值[4]。因此本实验将流动相的PH值确定控制在2.5。

2.3 柱温的选择

有机酸的保留，随柱温升高而减小，乙酸和乳酸的分离对温度变化很敏感。当温度超过20℃时，两者很难分开。本实验选择柱温为17℃。

2.4 标准色谱图

将有机酸标准溶液在上述色谱条件下进行，以面积外标法定量，得到7种有机酸的标准色谱图，如图1所示：

2.5 线性范围考察和标准曲线测定

准确配制一系列浓度的标准有机酸混合溶液，分别进样作色谱分析，测定其峰面积，以峰面积y对质量浓度x（μg/L）作图可知，y与x呈良好的线性关系，其线性回归方程和相关系数如表1。

表1 、线性回归方程和相关系数Table1 Theregression equations and correlation coefficient

2.6 样品含量测定

取处理样品，稀释至原浓度的1/40，进样10μL，在所选色谱条件下进行HPLC测定，其样品色谱图如图2，有机酸含量如表2。

表2 、武夷橙中有机酸的含量Table2 Determination resultsof someorganic acidsin WUYIOrange

由表2可知：武夷橙果肉中柠檬酸含量最高，占有机酸总量的52%以上。柠檬酸具有显著的保健效果，它不仅能有效促进体内乳酸分解，解除疲劳，改善精神状态，而且能增进食欲，保护肝脏和肾脏，具有防治疾病和延缓衰老等诸多功效[5]。可以预料，深度开发武夷橙及其产品将带来明显的经济和社会效益。

2.7 回收率及精密度试验

取处理样品，分别加入一定量的有机酸标准品，进行HPLC分析，每份样品重复测定3次，作加样回收率实验，测得7种有机酸的平均回收率为98%～110% ，平均相对标准偏差(RSD)分别为 2.26% ～3.79% 。实验结果如表3。

表3 、回收率测定结果Table3 Determination results of recovery

3 结论

研究结果表明，采用HPLC测定武夷橙中有机酸的含量，样品制备简便，分离效果好。武夷橙有机酸组分在C18柱上得到了基线分离，且具有良好的线性关系，方法的精密度和回收率都很高,速度快，结果准确可靠。此方法的建立，为武夷橙及其产品开发的分析测定提供参考。

[1] 丁明玉，陈培榕，罗国安.食品中有机酸的高效液相色谱分析法[J].色谱，1997，15(3)：212～215.

[2] 于世林.高效液相色谱法及应用[M].北京：化学工业出版社，2000.

[3] 朱明华.仪器分析(第3版)[M].北京：高等教育出版社，2000.

[4] 赵景婵.有机酸类化合物的反相高效液相色谱的分离条件研究[J].色谱，2001，19(3)：260～262.

[5] 李友元，陈长华，陶萍.高效液相色谱测定螺旋霉素发酵液中的有机酸[J].色谱，2002，20(1)：46～48.