＊1 沼泽红假单胞菌CQV97菌株对污染水体三氮去除特性研究

＊1沼泽红假单胞菌CQV97菌株对污染水体三氮去除特性研究

在不同污染程度模拟水体中，利用沼泽红假单胞菌CQV97，在厌氧光照条件下，研究了水体中氨氮、硝态氮和亚硝态氮含量、菌体生物量和水体p H的变化关系.随时间延长，CQV97菌株对氨氮、硝态氮或亚硝态氮去除量增大，生物量增加，水体p H升高；随氨氮浓度提高，生物量增加，氨氮低于33.2 mg／L能被完全去除，最大去除量达84.2 mg／L，水体p H维持在9.2～9.4；随硝态氮浓度的升高，菌体生物量降低，浓度低于216.96 mg／L能被完全去除，p H维持在9.1～9.3.随亚硝态氮浓度增加，菌体生长延滞期延长，生物量和p H升高幅度降低，浓度低于128.2 mg／L能被完全去除.结果表明，CQV97菌株对氨氮、硝氮和亚硝氮具有良好的去除能力.

沼泽红假单胞菌；氨氮；亚硝态氮；硝态氮

0 引言

集约化水产养殖的快速发展、饵料过度投放、化学药剂和抗生素的滥用，使养殖水体生态环境遭到严重破坏［1－3］，水体的自净能力大大下降.水体中氨氮和亚硝态氮等浓度升高，若不及时去除，不仅导致水生动物中毒和致病，水产品质量也会严重下降［3－5］，解决这一问题的关键是尽快恢复养殖水体的生态平衡.微生物修复技术在水体修复和养殖病害控制方面独具优势，是用于恢复养殖水体健康生态的一种有效策略［5－6］.但由于养殖水体环境和成分复杂多变，因此，搞清楚微生物菌种对环境的适应性及其影响因素是该项技术有效实施的关键环节.

目前用于修复和改善养殖水体的微生物菌种主要包括硝化细菌、不产氧光合细菌（简称光合细菌）、诺卡氏菌、芽孢杆菌、假单胞菌和酵母菌等类群［5］等.光合细菌是自然界水体自净的主要功能类群，可在有光或黑暗、厌氧或有氧环境中将异养菌分解大分子有机物产生的代谢产物（有机酸、有机醇、硫化氢及氨等）作为营养基质而繁殖，既净化了水质，又不与养殖对象争氧，细胞菌体还可被鱼类等水生动物所捕食，因而在水产养殖上显示出多重功效.但与芽孢杆菌和酵母菌类相比，光合细菌在自然环境中生长相对缓慢，不能满足现代养殖水体高效净化的要求，需要予以补充，这也是多年来光合细菌等制剂在市场上经久不衰的主要原因.

沼泽红假单胞菌是我国允许使用的饲料级微生物之一，用于养殖水体的调节和修复的研究已有许多报道［7－12］，尚少见到在有机酸存在下，光合细菌对氨氮、亚硝氮和硝氮去除规律的系统研究.本文选用一株对多环芳烃菲和多种有机物、氮化物和硫化氢具有降解和转化能力的沼泽红假单胞菌CQV97菌株［13］为研究对象，分别配制氨氮、亚硝态氮和硝态氮污染程度不同的含有乙酸钠的模拟污染水体，在人工控制的厌氧光照环境中研究了该菌株在小分子有机酸存在下，对水体中氨氮、亚硝态氮和硝态氮的去除规律和特性，为微生物水质净化调节剂的实际应用提供参考.

1 材料及方法

1.1 菌种来源

沼泽红假单胞菌CQV97（RhodopseudomonaspalustrisCQV97），GenBank登录号 EU882154，本实验室分离鉴定并保存在海洋资源微生物菌种保藏中心（MCCC 1I00117）.

1.2 主要试剂

氯化铵、亚硝酸钠、硝酸钾均为国产优级纯试剂；无水乙酸钠、氯化汞、氢氧化钾、酒石酸钾钠、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酰胺、钼酸铵、硝酸铋等均为国产分析纯试剂.

1.3 培养基和CQV97菌剂的制备

配制改良的Ormerod培养基［14］，用2.46 g乙酸钠取代其中的6.0 g·L－1苹果酸钠，接种量为5%（V／V），接种后培养瓶用无菌培养基充满，于30℃、3 000 lx光照厌氧培养4 d，得到CQV97制剂.

1.4 溶液配制

精确称量，用无氨水定容，配制氯化铵、硝酸钠和亚硝酸钠溶液，浓度均为2.25 mol／L，溶液分别用0.22 μm滤膜过滤除菌备用.

1.5 模拟污染水体样品的制备

1.6 氨氮、硝态氮、亚硝态氮的去除

1.7 生物量的测定

采用比浊法测定，以660 nm处的光密度（OD660）表示菌体生物量.在光程为1 cm比色杯中于UV－3200PCS紫外可见分光光度计（MAPADA）测定光密度.

1.8 p H测定

用METTLER－TOLEDO－320 p H计测定样品的p H值.

1.9 氨氮、硝态氮、亚硝态氮的测定和计算

其中：C0为初始浓度，Ct为终浓度.

2 结果与分析

2.1 菌株CQV97对氨氮的去除特性

菌株CQV97在污染程度不同的氯化铵－乙酸钠模拟水体中，水中氨氮含量、p H变化以及菌体增殖随时间变化过程见图1（P559）.从图1可以看出，在10 d处理期内，随时间延长，不同污染程度水体中的氨氮浓度均降低（图1A），菌体生物量升高（图1B），水体p H升高（图1C）.菌体细胞增殖速率较快，4 d进入平衡期，4 d内氨氮去除速率较快，p H上升幅度较大，之后氨氮去除速率、菌体增殖速率、p H升高幅度都减缓并趋于稳定.在污染浓度较低的氨氮（33.23 mg／L）水体中，氨氮在4 d内被耗尽，菌体不再增殖，而污染程度较高水体中的氨氮则尚未耗尽，菌体继续缓慢增殖，p H也随着氨氮浓度的升高而上升幅度减缓，最终趋于相同.

图1 模拟污染水体中NH＋4－N（A）、菌体增殖（B）及水体p H（C）随时间变化曲线Fig.1 Changes of NH＋4－N concentration（A），cell growth（B）and p H（C）in different polluted water sample.

水样中起始氨氮浓度对氨氮去除量（r）、去除率（R）、菌体生物量和p H影响见图2（P559）.当氨氮浓度为33.23～139.82 mg／L时，经过10d处理，CQV97菌株的生长未受到明显抑制，菌体生物量增加，水样p H升高并趋于一致（9.2～9.4）.氨氮的去除与起始浓度有明显的关联，随氨氮浓度增加，去除量也增大；当起始氨氮浓度为108.25 mg／L时去除量为84.21 mg／L，达到最大去除量.去除率则随着氨氮浓度的增加而降低，在低浓度（≤33.23 mg／L）时，氨氮能被完全除去；当氨氮浓度较高时，虽然去除量在增大，但水体中残留量也相应增大，去除率减小.结果表明：用CQV97菌株处理污染程度不同的氨氮－乙酸钠模拟污染水体，水体中氨氮的去除量、菌体生物量和水体p H呈相关性，在氨氮被去除的同时，菌体生物量，p H也升高.待系统达到平衡后，随起始氨氮浓度的增加，菌体对氨氮的去除量增加，逐渐达到最大去除量，菌体生物量和水体p H也随之增加均达到最大值.在该封闭体系中，p H成为氨氮最大去除量和最大生物量的限制因素，若菌体生长良好，p H未达到最大值，则氨氮能被完全清除.

图2 起始浓度对氨氮去除量（1）、去除率（2）、菌体生物量（3）和p H（4）的影响Fig.2 Effects of initial concentrations ofN on removal amount（1），removal rate（2），cell growth（3）and p H （4）

2.2 菌株CQV97对硝态氮的去除特性

在不同污染程度的硝酸钠－乙酸钠模拟水体中加入CQV97菌剂光照厌氧处理7 d，硝态氮浓度、菌体增殖及水体p H随时间的变化曲线见图3（P560）.随着时间的延长，水体中硝态氮含量不断被去除（图3A），菌体生物量和水体p H也逐渐升高（图3B，3C）.2 d内硝态氮的去除速率较低，菌体生长处于潜伏期，但p H则明显升高.随后去除速率增加并很快达到100%，菌体生长也进入对数生长期，水体p H继续上升，4 d后达到平衡.硝态氮起始浓度对硝态氮去除量、去除率、菌体生物量和水体p H的影响见图4（P560）.当水样中硝态氮浓度为45.37～216.96（mg／L）时，随着硝态氮浓度的升高，菌体生物量降低，但硝态氮均能被完全去除.初始硝态氮浓度低，水体p H升高幅度低，初始浓度高，p H升高幅度高，并趋于相同，维持在9.1～9.3之间.当起始浓度达到216.96 mg／L时，p H进一步升高.结果表明：在乙酸盐环境中CQV97能够较好地利用和转化硝态氮并将其快速有效的去除，使水体p H升高.但与氨氮相比，硝态氮对菌体的生长有一定的抑制作用.

2.3 CQV97对亚硝态氮的去除特性

对水生生物来说，亚硝酸盐是有害物质.在亚硝酸钠－乙酸钠模拟污水中，加入CQV97菌剂光照厌氧处理，亚硝态氮浓度、菌体增殖及水体p H随时间变化曲线见图5，亚硝态氮起始浓度对硝态氮去除量、去除率、菌体生物量和水体p H的影响见图6.如图5所示（P560），在8 d内随着时间延长，水中亚硝氮浓度降低，菌体生物量升高，p H也升高.随着初始亚硝态氮浓度升高，菌体生长潜伏期延长，生物量和水体p H降低（在7.2～7.5范围内）.如图6所示（P561），当初始亚硝态氮浓度在小于128.21 mg／L时，在8 d内，随着亚硝态氮浓度的升高，其去除量逐渐升高，去除率能达到100%；随着初始浓度的进一步升高，亚硝态氮的去除量和去除率逐渐降低.亚硝态氮对菌体生长和水体p H升高具有抑制作用，且随着浓度的升高，抑制作用增强.当浓度大于175.21 mg／L时，菌体几乎不生长，p H升高幅度较低.结果表明：CQV97具有去除水体中亚硝态氮的能力，随着时间延长，菌体生物量增加，水体中亚硝态氮的去除量升高，水体p H略有升高.亚硝态氮对CQV97生长具有抑制作用，高浓度抑制作用明显，但CQV97仍对亚硝态氮具有良好的利用和转化能力.

图3 模拟污染样品中NO＋3－N含量（A）、菌体增殖（B）及水体p H（C）随时间的变化曲线Fig.3 Changes of NO－3－N concentration（A），cell growth（B）and p H（C）in different polluted water

图4 NO－3－N起始浓度对亚硝氮去除量（1）、去除率（2）、菌体生物量（3）和p H（4）的影响Fig.4 Effects of initial concentrations of NO－3－N on removal amount（1），removal rate（2），cell growth（3）and p H （4）

图5 模拟污染样品中NO－2－N含量（A）、菌体增殖（B）及水体p H（C）随时间的变化曲线Fig.5 Changes of NO－2－N concentration（A），cell growth（B）and p H（C）in different polluted water

3 讨论

图6 NO－2－N起始浓度对亚硝氮去除量（1）和去除率（2）、菌体生物量（3）和p H（4）的影响Fig.6 Effects of initial concentrations of NO－2－N on removal

养殖水体中要求氨氮控制在0.025 mg／L以下，超过0.2 mg／L时，不仅危害水生生物，而且严重破坏水体生态环境.随着水产养殖集约化发展，我国养殖水体中氨氮浓度严重超标，甚至达到5 mg／L以上.亚硝酸盐含量要求小于0.1 mg／L，但有些养殖水体含量超标6倍以上.一般认为，NO－3－N对水生动物没有不良影响［4］，但若浓度较高（60 mg／L）且维持较长时间，则对生物会造成一定危害.若水体缺氧，则可能经过铵异化硝酸盐还原过程，产生氨氮和亚硝酸盐危害水生动物.因此，如何有效控制复杂养殖水体中的氨氮、亚硝态氮的浓度，是多年来一直困扰人们的难题.

沼泽红假单胞菌已有多个菌株用于水质调节作用的研究，但因使用的菌株不同，去除氨氮和亚硝态氮的能力有所差异，而且其去除能力受到光强、起始p H、温度以及多种底物等多种因素的影响［8－12］.虽然有沼泽红假单胞菌培养过程中菌体生长量与氨氮消耗关系的报道［11－12］，但尚不能解释小分子有机酸盐存在的养殖水体中，光合细菌对水体中氨氮、亚硝态氮和硝氮等物质的去除量、菌体生长和水体p H变化之间的关系和规律.本研究在含有乙酸钠的体系中，着重阐明了沼泽红假单胞菌对污染水体中氨氮、硝氮和亚硝氮去除过程中去除量、生物量和水体p H变化规律.结果表明，分离鉴定的能够耐受和利用菲的CQV97菌株［13］，对水体中氨氮、硝氮和亚硝氮具有良好的去除能力和耐受能力，在氮素去除过程中的一般规律是氮素被去除，菌体生物量增加，水体p H升高；但对不同氮素去除过程中又呈现不同的特点.菌体能够利用这三态无机氮生长，但生长的潜伏期长短、生物量和水体p H升高的幅度不同，对氨氮和硝态氮利用能力较强，菌体生长良好，水体p H升高幅度大，对亚硝态氮利用能力较低，菌体生物量较低.在一定浓度范围内，随着水体中硝态氮和亚硝态氮浓度升高，菌体生物量降低，但硝态氮和亚硝态氮均能被完全除去，则表明菌株CQV97对硝态氮和亚硝态氮也具有良好的转化能力，但究竟是通过铵异化硝酸盐还原（DNRA）还是通过反硝化作用转化？是否能够调控？还需要进一步研究.同时也提示，光合细菌对亚硝态氮具有很强的去除能力，但由于受到亚硝态氮的抑制，在自然界生长缓慢，因此需要适时补充光合细菌制剂以降低水体亚硝态氮含量，降低其对水生生物的毒性作用.

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赵玥，赵春贵＊，陈龑，杨素萍

（华侨大学 生物工程与技术系，福建 厦门361021）

Denitrifying Characterizations from Inorganic Nitrogen－polluted Wastewater byRhodopseudomonaspalustrisCQV97

ZHAO Yue，ZHAO Chun－gui，CHEN Yan，YANG Su－ping
（DepartmentofBioengineeringandBiotechnology，HuaqiaoUniversity，Xiamen361021，China）

The relationship among removal amount and removal rate of ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrite nitrogen，biomass as well as p H change in simulation wastewater polluted by different nitrogen compounds withRhodopseudomonaspalustrisCQV97 were investigated under anaerobically in the light.The results showed that strain CQV 97 had better capability of ammonia nitrogen removal.The removal amount and removal rate of ammonia nitrogen，biomass and p H increased during 10 d.With the increasing ammonia nitrogen concentration，the removal amount of ammonia nitrogen and biomass enhanced，p H reached at 9.2～9.4，but the apparent removal rate of ammonia nitrogen reduced.Less than 33.2 mg／L ammonia nitrogen could be completely removed.The maximal removal amount of ammonia nitrogen reached 84.2 mg／L.In the nitrate nitrogen－containing polluted wastewater，strain CQV97 could utilize，transform and rapidly and effectively remove nitrate nitrogen，cell growth and p H gradually increased while the nitrate nitrogen was constantly removed.With increasing nitrate nitrogen concentration，the biomass decreased，p H maintained at 9.1～9.3.The nitrate nitrogen could be removed completely and the maximal removal amount of nitrate nitrogen reached 216.96 mg／L.Strain CQV97 also was able to utilize and transform nitrite nitrogen in wastewater polluted by nitrite nitrogen，but cell growth showed lag phase，pH rised no more than 7.5.With increasing nitrite nitrogen concentration，the increasing rate of cell growth and p H reduced.The removal rate of nitrite nitrogen could reach 100%when the amount of nitrite nitrogen below 128.2 mg／L.In general，strain CQV97 has better removal ability to ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrite nitrogen.

Rhodopseudanonaspalustris；ammonia nitrogen；nitrate nitrogen；nitrite nitrogen

Q917.1

A

0253－2395（2012）03－0557－06＊

2011－12－03；

2011－12－19

国家自然科学基金 （31070054）；福建省自然科学基金（2010J01209）；中国科学院城市环境与健康重点实验室基金（KLUEH201005）

赵玥 （1987－），女，江苏人，硕士研究生，研究方向为微生物资源与开发.＊通信作者：赵春贵，教授.E－mail：chungui＠hqu.edu.cn