气体发泡PLA/PS共混高聚物制备组织工程支架研究

周长春,马 梁,董志红

(1.四川大学国家生物医学工程研究中心,四川成都 610044; 2.华盛顿大学机械工程系,美国西雅图 98195-2600; 3.成都大学工业制造学院,四川成都 610106)

0 引 言

传统的硬组织修复生物材料一般由不锈钢、钛及其合金制成,由于人体骨骼的刚性与金属材料的刚性相差很大,导致金属植入体会阻碍骨折部位周围骨痂的快速形成,从而破坏骨骼愈合过程中应该承受的正常应力环境,导致骨质疏松和骨萎缩,所以金属类植入体材料一般需要通过二次手术取出,这给患者带来了巨大的痛苦[6].由此,科研人员开始尝试利用可降解吸收的生物材料来对受损硬组织进行修复重建,PLA正是其中的研究热点之一[7-9].

作为可降解的硬组织修复材料,实体状态的PLA材料是不具有骨传导性的,唯有多孔的支架材料结构才有利于组织细胞的粘附、生长、增殖,并利于细胞养料的输送和废弃物的排泄,而制备可控制的三维多孔结构成为制备骨组织支架材料的关键[10].

本研究采用气体物理发泡工艺,对不可共混的双相高聚物PLA和聚苯乙烯(Polystyrene,PS)材料进行多孔支架微观结构设计制备研究.由于经气体物理发泡的单相高聚物泡沫孔隙大多为闭孔结构,而组织工程支架材料设计要求必须为三维联通贯通孔结构,因此,本研究引入新相聚苯乙烯,以期在材料发泡以后经溶蚀工艺处理最终形成三维可控的多孔结构,通过发泡工艺控制泡沫材料的空隙结构和大小,从而制备具有高空隙率、联通孔径结构、孔径大小可控、可生物降解的三维多孔生物支架材料.同时,本研究还在制备的多孔支架上进行了成骨细胞的种植实验,结果显示,成骨细胞在支架中生长良好,增殖、分化效果明显,经过3周细胞种植,初步形成了三维立体的细胞团聚生长结构,成骨细胞在支架孔隙中的延伸,传递性良好.

1 材料与方法

1.1 材 料

实验所用材料包括:PLA来自于Natureworks LLC(Extrusion grade,4032D),PS来自于Dow Chemical;PLA和PS以50∶50的比重率共混并注塑挤压成形,试样呈乳白色,厚度为0.5～0.7 mm,密度为1.162 g/cm3;发泡剂气体来自于Airgas Nor Pac,Inc.的医学级CO2(99.95%纯度);溶解工艺中用到的有机溶剂Cyclohexane(C6H12assay by GC,corrected for water> 99.0%)与Dichloroethane(C2H4Cl2assay by GC,corrected for water>99.0%)来自于Mallinckrodt Baker, Inc.;人成骨细胞(Human osteoblast cells,cell line Hfob1.19)来自于美国标准菌种收藏所(American Type Culture Collection,ATCC);细胞培养液为容积比50%的Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)与50%Ham’s F12的混合液,Ham’s F12混合液中同时包含了10%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS).

1.2 方 法

在实验中,PLA/PS共混材料采用气体物理发泡工艺发泡.为了优化发泡工艺,以确定合适的气体吸附条件并为后续制备可控孔径的发泡材料作准备,本研究对2组不同条件的吸附实验进行了研究:吸附二氧化碳气体压力分别为2、5 MPa,发泡温度介于100℃～145℃区间调整,发泡时间选择为25 s、30 s、45 s,每组参数至少重复5个试样.在溶解工艺中,利用Cyclohexane与Dichloroethane试剂对 PLA、PS、PLA/PS共混材料、PLA/PS发泡材料等分别进行了溶解实验研究,将试样材料浸没在溶液中持续进行24 h到一周的溶解测试,期间按时间段取出试样,清洗、干燥、称量,以确定合适的溶剂.

2 多孔支架材料表征

制备好的发泡材料首先应对其材料特性进行测定,如材料相对密度测定,SEM微观结构观察,材料孔径大小测定以及空隙率测定等.本研究所用的电子扫描电镜设备为FEI Siron X L 30 EDAX EDS,用来观察未发泡材料及发泡后材料的微观结构.在SEM实验中,试样样品通过浸没在液氮中冷却脆化后,从样品中间折断,并在试样断口处喷镀上一层薄金膜.从SEM获取的样品图像经Image J图像处理软件来分析材料的孔径尺寸大小及分布.发泡后材料的孔隙率可以由以下公式计算,

式中,ε为试样的孔隙率;ρf及ρs分别为材料发泡后的密度与未发泡前的密度.发泡材料的密度可由阿基米德排水法测得,具体执行标准根据ASTM D-792 standard测定,其计算公式为,

式中,ρ为试样密度,wa为样品在空气中测得的重量,wb为样品浸没在蒸馏水中所测得的重量,ρw为所用蒸馏水的密度,该值在室温下为0.9975 g/cm3.

目前我国对PBL教学效果的评价尚无统一标准，大多选择主观评价或主观评价法与考核法相结合方式，大致从以下几方面进行评价：

3 成骨细胞种植

未发泡及发泡过后的PLA/PS共混试样在经过溶蚀处理后都被用于种植培育细胞.种植细胞前,所有试样均用清水漂洗多次,再用70%的乙醛浸泡30 min消毒,然后用紫外光照30 min杀菌.灭菌后的试样先浸泡在细胞培育液中3 d,预培养时,细胞首先被培育在含有DMEM培养基的细胞培养瓶中,培育环境为34℃以及5%CO2.预培养完成后,该细胞用0.25%的胰岛素经转速为1 000 rpm的离心机离心5 min从培养液中分离出来,去除顶层液体,将分离出来的细胞置于干净的皮氏培养皿中.然后,细胞以大约5×105个/mL的密度直接种植在准备好的试样中,1 d后细胞附着在试样上,其后,再往试样上添加2 mL的培养液,之后将试样放置在34℃,5%CO2的环境下进行细胞培育.

同时,为了更好地观察试样内的细胞生长情况,本研究将细胞进行了染色处理.实验中,细胞采用Live/dead viability/cytotoxicity kit(Invitrogen)染色,该物质包含2种荧光染料:Calcein AM与 EthD-1.其中,Calcein AM可以很好地在活细胞中保留并显示出较强的绿色荧光(显示波长范围:ex/em 495 nm/ 515 nm),而EthD-1则通过受损的细胞膜进入到细胞内部与核酸结合产生红色的荧光.EthD-1只能对死细胞进行染色.这样,活(死)细胞便可以通过此染色物质进行区分.最后,用荧光显微镜(LEICA M250 FA)观察细胞繁殖情况.

4 实验结果

4.1 发泡可控工艺参数对支架孔隙的影响

在气体物理发泡工艺中,有2个因素将影响发泡材料的泡沫空隙及特性,即发泡时试样所吸附的CO2气体浓度及发泡能量.其中,发泡能量又由发泡过程中的发泡温度和发泡时间所决定.对吸附同等气体浓度的试样来说,发泡工艺参数对发泡材料的泡沫孔径有着直接影响,它们构成了发泡工艺的可控工艺参数.表1所示为本研究中采用的可控工艺参数.

表1 实验采用的气体物理发泡工艺参数

发泡工艺参数对发泡材料泡沫孔径的影响如图1所示.

图1 发泡工艺参数对发泡材料泡沫孔径的影响

从图1可看出,在发泡温度为100℃～125℃区间,发泡材料的泡沫孔径尺寸呈递增趋势,该值由20μm增加到70μm.当发泡温度超过125℃以后,发泡材料的泡沫孔径尺寸则呈递减趋势,孔径由70 μm减小到50μm左右;比较不同的发泡时间可见,发泡时间为30 s的时候,得到的泡沫孔径尺寸为最大,20 s时次之,45 s最小,并且这个现象对所有发泡温度都呈一致规律变化.其原理是:在发泡过程中,材料内部首先形成无数的泡沫初核,不同的发泡温度意味着不同的发泡能量,它们将产生不同数量的泡沫初核,这些泡沫初核随着发泡时间的延续逐渐长大,在未达到发泡能量极值/临界点之前(如在本实验中发泡温度为100℃～125℃区间),溶解吸附在聚合物矩阵中的CO2气体由于发泡能量的驱使,不断地从聚合物矩阵中扩散到成形的泡沫气核中,促使了泡沫的长大,泡沫的尺寸孔径呈现递增趋势;但在超过发泡能量极值/临界点之后,由于发泡能量过高,高温致使聚合物材料软化,无法继续支撑过度膨胀的气泡,因而一部分气体将从破裂的材料表皮或侧面逸出,从而导致泡沫壁破裂、坍塌,使得泡沫孔径尺寸减小.

不同的气体吸附压力与浓度对材料的泡沫孔径影响如图2所示.

图2中,图2(a)的气体吸附压力为2 MPa,发泡时CO2的浓度为5.31%,其泡沫孔径大小为10μm～20μm,图2(b)的气体吸附压力为5 MPa,发泡时CO2的浓度为9.23%,其泡沫孔径大小为20μm～40 μm.图2中,亮白色的区域为PLA材料相,暗黑色的区域为PS相,镶嵌于发泡后的PLA矩阵中,从图2可看出,PLA相和PS相各自团聚在一起,说明它们属于2种互不相容的材料,这为后续PS相的去除提供了可能.

图2 不同吸附气体压力与浓度对发泡材料泡沫孔径的影响

4.2 PS相去除溶蚀工艺

材料发泡后,泡沫中同时包含着PLA相和PS相,由于PS相不是一种可降解的聚合物,且PLA材料和PS材料的溶解性能不一样.故本研究选择环己烷(Cyclohexane)溶剂将PS相溶蚀掉,仅保留PLA相及其所具有的多孔结构,从而提高材料的孔隙率,增强其联通性能.

发泡后的试样PS相经溶蚀去除工艺处理后的扫描电镜图像如图3所示.

图3 试样PS相溶蚀去除的扫描电镜图像

图3中,图3(a)为未经溶解处理的PLA/PS共混试样经过发泡后的电子扫描电镜图像,经过发泡工艺,材料矩阵中可见明显的孔隙结构,暗黑色的PS相呈团聚状态镶嵌于较亮的PLA矩阵之中,图中可见一些明显的孔隙通道,这些孔隙通道可为溶解处理提供便利以供溶液进入材料内部,图示泡沫孔径尺寸大小大约为10μm～30μm.图3(b)为经过发泡后的PLA/PS试样在溶解过程中的扫描电镜图像,图像显示,经过溶解处理,绝大部分的PS相已经被溶解去除掉了,少许的PS(图中圆圈中所示区域)附着在PLA的泡沫孔隙中处于正在被溶蚀之中.图3 (c)、(d)为发泡后的PLA/PS试样经过7 d的溶蚀处理后,PS相完全被溶蚀掉后的电子扫描电镜图像,图3(c)为沿X轴折断的横截面图像,图3(d)为沿Y轴折断的横截面图像,试样在这两个方向上的结果大致相同,泡沫尺寸进一步增大,孔隙率大为提高,且试样在3维空间结构下呈现出一种均匀、联通的多孔中空泡沫结构,各个泡沫单元间彼此联通.

4.3 细胞种植实验结果

细胞经过不同培养时间段的生长情况如图4所示.

图4 细胞在经过不同培养时间段的生长情况

图4中,图4(a)为细胞刚刚种植的情况,图4 (b)为细胞经过一周培养的情况,图4(c)为细胞经过两周培养的情况.从图4(a)可看出,细胞刚种植时,在试样内部几乎不能看见任何细胞,可见此时细胞尚为附着、扩散至支架内部.经过一周时间的培养(见图4(b)),细胞数量有了很大的增殖,且生长情况良好.经过2周左右的时间培养(见图4(c),细胞得到了更大程度的增殖.初步统计发现,增殖的细胞与细胞培养的时间呈现出一种几何数量级的增殖.支架材料的三维孔隙结构为成骨细胞的繁殖提供了诱导性的组织结构,较高的孔隙率及相互联通的孔隙为细胞的延展、细胞养料及废弃物的输送提供了通道,从而促进了成骨细胞在支架孔隙结构中的蔓延生长和分化传递.

成骨细胞在二维及三维环境中的生长情况如图5所示.

图5 成骨细胞在二维及三维环境中的生长情况

图5中,图5(a)为成骨细胞在三维多孔PLA支架材料上的生长情况,图5(b)为成骨细胞在二维培养皿表面上的生长情况.从图5(a)可以看出,成骨细胞在三维的PLA多孔支架材料上,细胞的增殖、生长情况很好,图中荧光区域显示为繁殖的活体细胞,它们呈球形或扁长状在试样内部构建起了一种三维特征结构,并随着PLA的多孔结构在生物体内被逐渐代谢掉,新生的细胞将占据其原有的空间.因此,这类可降解的多孔支架材料可用作骨诱导生长或是修复、替代生物材料.从图5(b)可以看出,尽管在二维的玻璃表面细胞的增殖生长情况很好,但是其无法构建类似于生物体内的三维空间结构,新生细胞无法快速有效地形成空间结构和组织,此表明实心状态的材料不适宜用于做诱导性的组织工程材料.

5 结 论

利用气体物理发泡工艺可以制备一类多孔组织工程支架材料,支架的空隙结构可以通过调控发泡工艺中的可控参数进行优化设计.气体物理发泡过程中,气体的吸附压力、吸附时间,发泡过程中的发泡温度、发泡时间将对材料的最终孔隙结构产生影响.发泡后对材料进行溶蚀工艺处理,可以有效去除掉镶嵌的不可共混PS相,从而获得具有联通特性的孔隙结构.通过对该支架材料进行成骨细胞种植实验,结果表明,细胞在支架内生长情况良好,经过2周培养,细胞初步表现出三维空间蔓延传递生长的特征.对比二维以及三维成骨细胞种植结果发现,尽管在二维的玻璃表面细胞的增殖生长情况很好,但其无法构建类似于生物体内的三维空间结构,新生细胞无法快速有效地形成空间结构和组织,表明实心状态的材料不适宜用做诱导性的组织工程材料.本研究表明,经此方法制备的多孔支架材料有望进一步研究开发而成为一种优良的用于组织工程修复的生物材料.但需要说明的是,许多研究工作,包括材料的力学性能表征、生物特性评估以及动物体内实验等,还有待进一步深入.

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