小黄鱼蛋白酶水解工艺研究

纪莹， 张国增，， 周素梅

（1.大连民族学院 生命科学学院，辽宁 大连 116600；2.中国农业科学院 农产品加工研究所，北京 100094）

小黄鱼蛋白酶水解工艺研究

纪莹1， 张国增1，2， 周素梅2

（1.大连民族学院 生命科学学院，辽宁 大连 116600；2.中国农业科学院 农产品加工研究所，北京 100094）

以小黄花鱼为原料，以水解度为指标，利用蛋白酶解技术对小黄鱼蛋白进行酶解。单酶水解实验中，选用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶，结果表明，以木瓜蛋白酶酶解小黄鱼其水解度最高，故选择木瓜蛋白酶为最佳酶，并在此基础上进行酶解工艺的研究。小黄鱼蛋白酶解工艺研究中，主要研究料液比、酶解温度、加酶量和酶解时间对水解效果的影响。结果表明，水解度随加酶量、水解时间、料液比以及温度的增加而增加，但在加酶量0.2 mg／d L、水解时间4 h、料液比1∶3（g∶m L）之前水解度增加速度较快，之后其增加速率明显减慢；从正交实验中得到最佳组合为：水解温度为60℃，水解时间为4 h，加酶量取0.2，料液比为1∶5（g∶m L）。各因素对水解度的影响顺序为：料液比＞ 酶解温度＞ 加酶量 ＞ 酶解时间。经正交实验优化后，其水解度最高可达49.50%。

小黄鱼；蛋白质；酶解

小黄鱼为我国主要经济鱼类之一，主要分布在我国渤海、黄海和东海。其肉质鲜嫩，营养丰富，是优质食用鱼，也是婴幼儿及病后体虚者的滋补和食疗佳品，但是由于加工方式传统，小黄鱼尚未得到充分开发［1］。以鱼肉蛋白为底物，利用控制酶解技术生产具有生物活性的酶解产物是一个值得深入研究的领域，。将鱼肉蛋白控制酶解后不仅可增大溶解性，提高营养价值，而且产生了蛋白质所不具备的活性，因此可极大提高淡水鱼的附加值［2－6］。

本文主要研究了单酶水解小黄鱼的最佳酶解工艺，为提高小黄鱼的利用，增加其经济附加值提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验原料：小黄鱼，市售；主要试剂：碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶均购自丹麦诺维信公司；木瓜蛋白酶购自广西庞博生物科技公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验仪器和设备

PHS－3C酸度计：上海精密科学仪器有限公司；SBH－B型水浴恒温震荡摇床：上海丰盟科技材料有限公司；PL203电子秤：梅特勒－托利多电子精密仪器厂；UV－2100型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；LXJ－ⅡB型低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；DS－1高速组织捣碎机：上海标本模型制造厂。

1.3 实验方法

1.3.1 原料处理小黄鱼，经去头、去皮及内脏后将血水和黑膜等清除清洗干净，取鱼肉（去鱼刺），分份装入双层聚乙烯袋中，置于－20℃冷冻备用。

1.3.2 小黄鱼蛋白酶解工艺流程鱼肉→（解冻）→破碎→匀浆→鱼糜液→90℃下预处理10 min→冷却→加碱性蛋白酶的一组调p H至8.0→加入蛋白酶→酶解→将酶解液置于沸水浴中加热灭酶（5 min）→冷却→离心（4 000 r／min，15 min）→蛋白酶水解液

1.3.3 不同蛋白酶酶解小黄鱼蛋白的研究按如上工艺条件，在0.5 mg／d L（以蛋白量计）加酶量、55℃、料液比1∶4（g∶m L）的条件下，分别选用碱性蛋白酶（Alcalase）、复合蛋白酶（Protemex）、木瓜蛋白酶（Papin）、风味蛋白酶（Flavourzyme）4种蛋白酶对小黄鱼蛋白酶解4小时，测定其水解度，从而选取最佳水解单酶。

1.3.4 小黄鱼蛋白酶解工艺参数的单因素实验

1）酶浓度对木瓜蛋白酶酶解的影响 控制固液比1∶4（g∶m L）、酶解时间为3 h、温度为55℃、在不同的加酶量（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg／d L）下酶解小黄鱼肉蛋白，测定其水解度。

2）温度对小黄鱼蛋白酶解的影响 控制料液比为1∶4（g∶m L）、酶解时间为3 h、加酶量0.5%（mg／d L）、在不同的温度 （30、40、50 、60 ℃）下酶解小黄鱼肉蛋白，测定其水解度。

3）酶解时间对小黄鱼蛋白酶解的影响 控制料液比为1∶4（g∶m L）、酶解温度为55℃、加酶量0.5 mg／d L、在不同的时间（1、2、4、6、8 h）酶解小黄鱼肉蛋白，测定其水解度。

4）料液比对小黄鱼蛋白酶解的影响 控制酶解温度为55℃、酶解时间为3 h、加酶量0.5 mg／d L、在不同的料液比（mg∶d L）（1∶2、1∶3、1∶4、1∶6、1∶8）下酶解小黄鱼肉蛋白，测定其水解度。

1.3.5 优化小黄鱼蛋白酶解工艺参数的正交实验

根据单因素试验结果，选择不同酶解因素的适当水平，进行正交实验。以蛋白水解度为指标确定最佳酶解条件组合。

1.3.6 水解程度评价蛋白质的水解度（DH）被定义为，水解断裂的肽键数占样品蛋白质中的总肽键数的百分数。实验采用TCA法［7］。

蛋白质水解度（DH）＝（水解液可溶于10%TCA的氮量／总氮量）＊100%

1.3.7 样品的总氮质量的测定半自动凯氏定氮法［8］。

1.3.8 TCA可溶性氮质量的测定福林－酚法测定［9］。

2 结果与分析

2.1 最适蛋白酶的确定

木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶对小黄鱼蛋白酶解的水解度均比较高，但以木瓜蛋白酶为最高，而风味蛋白酶的水解度明显很低（见图1）。因此，选取木瓜蛋白酶为最佳酶解用酶，并以此酶进行一下实验，进一步研究其最佳酶解工艺，以提高水解度。

图1 不同蛋白酶酶解小黄鱼肉蛋白的水解度Fig.1 Effect of protease type on the hydrolysis of small yellow croaker fish protein

2.2 加酶量对木瓜蛋白酶水解度的影响

随着酶用量的增加，水解度也会随之会逐渐增高，但水解度在加酶量小于0.2 g／d L时会随酶量增加而迅速增加，在酶用量高于0.2 g／d L之后，虽然水解度仍在提高，可其增加速度明显下降（见图2）。这很可能是由于生成的蛋白酶解物对酶的抑制或所有可以被酶作用的肽键都已与酶结合，即酶用量已经饱和所导致。酶解液中高浓度的可溶性短肽会使酶解反应速率下降［10］。因此，如果在反应同时除去反应液中的酶解物，可能会使酶解反应速率和水解度都有所升高，从而提高生产效率和经济效益。

图2 加酶量对水解度的影响Fig.2 Effect of enzyme content on the hydrolysis of small yellow croaker fish protein

2.3 酶解温度对木瓜蛋白酶水解度的影响

由图3可以看出，水解度随温度上升，不断升高。但在50℃～60℃时其水解度升高程度已变得平缓，根据生产厂家给出的最佳水解温度50℃，并考虑到实际生产中成本及温度过高不易控制等因素，故没有继续更高温度的实验。

图3 酶解温度对水解度的影响Fig.3 Effect of temperature on the hydrolysis of small yellow croaker fish protein

2.4 酶解时间对木瓜蛋白酶水解度的影响

随酶解时间的增加，料液的水解度逐渐增加，在2～4 h内水解度的增加十分显著，4 h之后其增加程度趋于平缓，水解度增加不大，基本达到其最大值（见图4）。其可能有两方面原因。第一，随时间的增加，蛋白逐渐被水解为短肽，酶底物减少，产物增加，这都是降低酶反应速率的因素，使水解速度下降；第二，本实验所用方法是用TCA将大分子蛋白及短肽沉淀后的可溶性蛋白含量，而当水解出大量短肽后，可能促使木瓜蛋白酶催化大量短肽进一步水解为更短的小肽，此时的前后两种短肽都无法被TCA所沉淀，使得虽然有水解在发生，但所测水解度变化不大［11］。

图4 酶解时间对水解度的影响Fig.4 Effect of enzymatic time on the hydrolysis of small yellow croaker fish protein

2.5 料液比对木瓜蛋白酶水解度的影响

随料液比的增加水解度随之增加，在料液比小于1∶3（g∶m L）时，随料液比其水解度增加速度交快，在料液比1∶3（g∶m L）之后，水解度增加速度十分缓慢。其原因可能是液固比较小时，也许底物浓度过高，分散不均匀，过多底物分子堆集于酶的活动中心，从而会影响酶催化速度及产物分子的扩散，故水解度较低；液固比过大的话，一方面虽然使底物分散更均匀，溶解度增加，但同时酶的浓度下降，势必对蛋白水解造成不利影响［12］。

图5 料液比对水解度的影响Fig.5 Effect of the ratio of small yellow croaker fish to water on the hydrolysis of small yellow croaker fish protein

2.6 优化小黄鱼蛋白酶解工艺条件的正交实验

为了得到较准确的工艺条件及参数，对加酶量、酶解温度、酶解时间、料液比4个主要因素，以水解度为指标，采用L9（34）正交设计进行实验，对酶解小黄鱼蛋白的条件进行了优化，实验安排见表1，实验结果见表2。

表1 木瓜蛋白酶的正交实验因素与水平Tab.1 Factors and level of orthogonal experiment

表2 木瓜蛋白酶酶解条件正交实验及结果Tab.2 Results of orthgonal experiment

续表2

对正交试验的结果采用极差分析的方法比较各因素对试验结果的影响大小。根据表3中计算的极差的大小可以看出，各因素对水解度影响的主次顺序为：料液比＞酶解温度＞酶用量＞酶解时间，可知料液比对木瓜蛋白酶酶解小黄鱼蛋白水解度的影响最大，而酶解时间对水解度的影响则很小。并可得出最适水解条件为A3B1C3D3，即水解温度为60℃，水解时间为4 h，加酶量取0.2 mg／d L，料液比为1∶5（g∶m L），其水解度可达49.50%。

表3 木瓜蛋白酶酶解条件正交实验极差分析Tab.3 Range analysis of the orthogonal experiment

3 结语

本文以小黄花鱼为原料，以水解度为指标，利用蛋白酶解技术对小黄鱼蛋白进行酶解，研究结果如下：

1）以水解度为选酶指标，选用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶对小黄鱼鱼肉进行酶法水解，结果表明酶解效果木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶水解度都较高，但其中以木瓜蛋白酶水解度最高，风味蛋白酶最差。故采用木瓜蛋白酶作为酶解用最佳单酶，并在此基础上进一步研究其最佳水解工艺。

2）在单因素实验中可以看出，水解度随加酶量、水解时间、料液比以及30～60℃范围内温度的增加而增加，但在加酶量0.2 mg／d L、水解时间4h、料液比1∶3（g∶m L）之前水解度增加速度较快，之后其增加速率明显减慢。

3）从正交实验中得到最佳组合为：水解温度为60℃，水解时间为3 h，加酶量取0.4 mg／d L，料液比为1∶5（g∶m L）。各因素对水解度的影响顺序为：料液比＞酶解温度＞加酶量＞酶解时间。经正交实验优化后，其水解度可达49.50%。

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Hydrolyzing of Small Yellow Croaker Fish Protein

JI Ying1，ZHANG Guo－zeng1，2，ZHOU Su－mei2

（1.College of Life Sciences，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China；2.Institute of Agro－Products Processing Science and Technology Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100094，China）

In order to take full advantage of pseudosciaena polyactis and increase their added value，the hydrolyzing of small yellow croaker fish protein were studied in this manuscript.The enzymatic hydrolysis of protein in small yellow croaker fish by alcalase，flavourzyme，papain and protemex were firstly studied and papain was selected for further study with the degree of hydrolysis（DH）as index.Then the effect of papain on the the degree of hydrolysis（DH）was investigated by single factor test and orthogonal experiment.The results of the single factor test showed that DH increases with the amount of enzyme，hydrolysis time，the ratio of small yellow croaker fish to water and the temperature and the optimum conditions listed as follows：0.2 mg／d L enzyme，reaction time 4 h，the ratio of small yellow croaker fish to water 1∶3.Furthermore，the optimum conditions was determined by the orthogonal experiment，and listed as follows：the amount 0.4 mg／d L，hydrolyzed for 4h at 60℃and the ratio of mall yellow croaker fish to water at the ratio of 1∶5.The effect those factors on DH was the ratio of small yellow croaker fish to water＞temperature＞amount of enzyme＞time.

small yellow croaker，protein，enzymatic hydrolysis

纪莹（1980－），女，吉林通化人，工学博士，讲师，主要从事功能性食品及品质改良研究。E－mail：yingji＠dlnu.edu.cn

S 37

A

1673－1689（2012）05－0555－05

2010－10－28