免疫细胞化学法测定鱼类淋巴囊肿病毒（LCDV）滴度＊

宋佳蕾，绳秀珍，战文斌

（中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003）

免疫细胞化学法测定鱼类淋巴囊肿病毒（LCDV）滴度＊

宋佳蕾，绳秀珍＊＊，战文斌

（中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003）

利用免疫细胞化学法测定鱼类淋巴囊肿病毒（LCDV）滴度。以牙鲆鳃细胞系（FG）作为感染细胞，将生长旺盛的FG细胞接种于48孔培养板中培养至形成细胞单层，用2倍连续稀释的LCDV粗提液分别接种FG细胞。固定各稀释度LCDV感染后的FG细胞，孵育抗牙鲆LCDV单克隆抗体，其后再运用生物素－亲合素反应系统，以碱性磷酸酶底物APRed试剂盒发色。倒置显微镜观察，被病毒感染的FG细胞的细胞质呈现红色，未被感染细胞的细胞质呈无色。记录各稀释度病毒感染的阳性细胞孔数，按Reed－Muench法计算组织细胞培养半数感染量（TCID50）。结果显示，免疫细胞化学法测得LCDV在FG的滴度为1.77×210TCID50／mL。该法可以用来有效测定LCDV滴度，且结果直观、准确性较好，灵敏度较高。

淋巴囊肿病毒；牙鲆鳃细胞；组织细胞培养半数感染量；免疫细胞化学法

鱼类淋巴囊肿病（Lymphocystis disease，LCD）是1种典型的皮肤和浅表组织慢性病毒性疾病，呈世界性分布，可感染已知至少140种海水、半咸水和淡水鱼类，是对鱼类危害较为严重的病毒病之一，感染率可高达80%，死亡率可达30%，给水产养殖业造成重大经济损失［1］。其病原为淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus，LCDV），隶属虹彩病毒科（Iridoviridae），淋巴囊肿病毒属（Lymphocystivirus）［2］。研究发现LCDV可在蓝鳃鱼幼鱼细胞系BF－2、日本牙鲆胚胎细胞系HINAE、草鱼肾细胞系GCK、牙鲆鳃细胞系FG等细胞内增殖并引起细胞病变（CPE）［3－6］。

病毒滴度的测定是研究病毒特性的重要手段，也是病毒学研究中的基础方法。目前其测定方法有多种，如微量细胞病变法、空斑法、荧光法、红外荧光法、ELISA法、免疫斑点法、流式细胞仪法、荧光实时定量PCR法等［7－14］。以测定组织细胞培养半数感染量（TCID50）为基础的终点稀释法和以测定蚀斑形成单位（PFU）为基础的蚀斑滴定法是常用的病毒滴度测定方法［15］。终点稀释法相对于蚀斑滴定法，速度快，操作简便，重复性好［16］。该法将一系列梯度稀释病毒液分别接种于培养细胞单层，经过一定时间后观察细胞是否出现CPE，以最高病毒稀释度能感染50%细胞的量为终点，用Reed－Muench法或Karber法计算出TCID50表示病毒滴度［7，17］。本文选择FG细胞作为感染细胞测定LCDV的滴度，将LCDV粗提液接种于FG细胞单层，通过血清学反应和细胞染色判定病毒感染的细胞区域及细胞的感染程度，以免疫细胞化学法测定LCDV TCID50，相对于终点稀释法，具有结果直观、准确性好，灵敏度高的特点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

患LCD牙鲆取自山东某养殖场，病鱼的体表可见有单个或聚集成团的水泡状囊肿物；FG细胞系由中国海洋大学生命学院惠赠［18］；抗LCDV不同表位的单克隆抗体（1A8、1D7、2D11）由本实验室制备［19］，使用前等比例混合；胰蛋白酶Trypsin 1：250购自Amresco公司；MEM／EBSS培养基、胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司；牛血清白蛋白（BSA）、生物素化马抗小鼠IgG（H＋L）、碱性磷酸酶标记链亲和素、碱性磷酸酶底物AP－Red试剂盒购自Sigma公司。

1.2 LCDV粗提液的制备

将患LCD牙鲆体表的囊肿切下，剥去外膜，加入适量石英砂，用TNE缓冲液（0.05mol／L Tris－HCl，0.15mol／L NaCl，0.01mol／L EDTA，pH＝7.4）按1∶10比例进行研磨。冰浴匀浆，匀浆液600r／min，离心30min，取上清。1 800r／min再次离心30min，收集上清，经0.45μm微孔滤膜过滤除菌，分装于1.5 mL无菌离心管中，－80℃保存。

1.3 FG细胞单层的培养

将25cm2细胞培养瓶内生长旺盛的致密FG细胞（细胞密度约为3×105／mL）用细胞清洗液（含0.02%EDTA的PBS）洗涤2次，加入300μL 0.25%的胰蛋白酶消化，倒置显微镜下观察细胞收缩变圆后，加入10mL细胞培养液（MEM／EBSS培养基，10%FBS）吹打均匀制备细胞悬液，接种于48孔培养板中，每孔200μL。22℃，2%CO2培养24h后汇合率约为70%用于实验。

1.4 FG细胞上LCDV的感染

用MEM／EBSS培养基将LCDV粗提液按2－4、2－5、2－6、2－7、2－8、2－9、2－10稀释。吸去48孔培养板中细胞培养液，用PBS洗涤2次，分别接种各梯度浓度的病毒粗提液，每个稀释度接种6孔，每孔100μL。阴性对照加MEM／EBSS培养基代替病毒粗提液。22℃吸附1h后，加入细胞维持液（MEM／EBSS培养基，2%FBS）200μL，22℃，2%CO2培养。

1.5 TCID50的测定

1.5.1 免疫细胞化学法 按1.3的方法培养FG细胞单层。按1.4的方法感染FG细胞。病毒感染细胞后72h，弃细胞维持液，用PBS将FG细胞清洗2遍，4%多聚甲醛固定10min；0.1%Triton X－100通透10 min；3%BSA封闭1h，吸去BSA；以抗LCDV单克隆抗体（1A8、1D7、2D11）为第一抗体加在细胞上，37℃孵育1h，PBST（含0.05%tween－20）浸洗3次，每次5 min；加生物素标记的马抗小鼠IgG，37℃孵育1h，PBST浸洗3次，每次5min；加碱性磷酸酶标记链亲和素，37℃孵育1h，PBST浸洗3次，每次5min；以碱性磷酸酶底物AP－Red试剂盒发色10min；苏木精复染1min，0.1%盐酸分色，蓝化。倒置显微镜下观察，被LCDV感染的FG细胞的细胞质呈现红色为阳性，没有被病毒感染的细胞的细胞质呈无色为阴性；经苏木精复染后细胞核均呈现蓝色。记录被不同稀释度病毒感染的阳性细胞孔数。按Reed－Muench法计算

1.5.2 终点稀释法 按1.3的方法培养FG细胞单层。按1.4的方法感染FG细胞。每天在倒置显微镜下观察孔内细胞是否出现CPE，当CPE不再发展时，记录被不同稀释度病毒感染出现CPE的细胞孔数。按上述方法计算TCID50。

2 结果

2.1 正常FG单层细胞的形态观察

FG细胞消化后，细胞皱缩变圆（见图1B）。细胞传代48～72h后形成生长旺盛的单层，贴壁生长。细胞轮廓清晰，呈梭形、三角形、多角形等形态，具有长短不等的两个或数个细胞突起，形态饱满，大小均匀，呈现旺盛的生长趋势（见图1A）。

图1 消化前后FG细胞形态学特征（bar＝100μm）Fig.1 FG cells before or after administration of 0.25%trypsin（bar＝100μm）

2.2 感染病毒后细胞的形态观察

2.2.1 免疫细胞化学法检测LCDV对FG细胞的感染

接种2－4～2－8LCDV粗提液的FG细胞病毒感染后72h，免疫细胞化学法均可检测到阳性细胞。随着病毒稀释度的增大，检测到阳性细胞的比例减少。接种2－4LCDV粗提液的FG细胞，各孔阳性细胞呈弥漫性分布且视野中大部分为阳性细胞；接种2－5～2－6LCDV粗提液的FG细胞，各孔阳性细胞呈现区域性的成堆状分布；接种2－7～2－8LCDV粗提液的FG细胞，少数孔中有少量阳性细胞存在；接种大于2－8LCDV粗提液的FG细胞，免疫细胞化学法未检测到阳性细胞。

免疫细胞化学法检测可见细胞单层感染区域严重病变FG细胞呈现灶状空斑，细胞聚集，多数细胞的细胞质呈现红色（见图2A）；部分被病毒感染FG细胞变圆，细胞质呈现明显的红色；部分被病毒感染但形态未发生明显变化的细胞，细胞质呈现红色（见图2C）；未被病毒感染FG细胞的细胞质不着红色（见图2A，2C）；对照组FG细胞形态正常，细胞质不着红色（见图3E）；经苏木精复染后所有细胞的细胞核均呈现蓝色（见图2B，2D，2F）。

2.2.2 终点稀释法观察CPE 倒置显微镜下观察接种不同稀释度LCDV的FG细胞，发现2－4～2－6LCDV病毒粗提液均能引起CPE，随着病毒稀释度的增大，FG细胞出现病变的时间延后，病变细胞减少，随着感染时间的延长，病变细胞的数量增多，病变程度逐渐加重，病毒感染细胞120h后CPE不再变化。接种2－4～2－5LCDV病毒粗提液24～48h，FG细胞开始出现病变，72h出现少量死亡细胞，96～120h死亡细胞的数目增多，各孔均出现不同程度的CPE；接种2－6LCDV病毒粗提液，48h只有少数细胞病变，72～120h病变细胞数量增多，部分孔中细胞出现病变；接种稀释度大于或等于2－7LCDV粗提液的FG细胞病毒感染120h后未出现CPE。

LCDV感染FG细胞引起的CPE开始表现为病变细胞单层局部出现细胞间隙增大，疏松。部分细胞的轮廓逐渐失去突起，细胞收缩变圆，细胞空泡化逐渐加重（见图3A，3B，3C）。随着病变程度的加深，有的细胞破裂，从培养板底部脱落，形成灶状空斑（见图3D，3E）。对照组FG细胞形态正常，细胞状态良好，无CPE产生（见图3F）。

2.3 FG细胞上LCDV滴度的测定

LCDV感染FG细胞后72h，免疫细胞化学法测得病毒的滴度为1.77×210TCID50／mL。LCDV感染FG细胞120h后，出现CPE的细胞孔数目不再增加，终点稀释法以使50%感染细胞产生CPE的最高病毒稀释度作为判定结果，测得病毒的滴度为1.65×29TCID50／mL。

3 讨论

测定病毒滴度时，首先需要选择合适的感染细胞。已有报道感染LCDV后的FG细胞电镜下观察到细胞中有病毒粒子，光镜下观察到细胞脱落死亡出现蚀斑，免疫荧光法检测到细胞质中荧光信号的存在［6，20－21］，说明LCDV能在FG细胞中复制增殖引起感染，FG细胞是测定LCDV滴度的有效材料。关于病毒对细胞的感染，由于FBS中存在一些遮蔽细胞膜表面病毒受体的非特异性蛋白质、补体或其他小分子物质［22］，本文在接种病毒时，先用PBS清洗细胞单层，避免FBS的干扰使病毒对细胞的吸附量减少，从而降低病毒对细胞的感染。病毒吸附后采取加入FBS含量低的细胞维持液，使细胞代谢缓慢进行，延长细胞存活时间，防止营养耗尽、代谢产物积聚、pH值下降等因素导致细胞形态改变、脱落、死亡等现象而影响病毒滴度的测定。

TCID50已被用于许多种病毒的滴度测定，表示使50%的培养细胞感染，产生CPE的最小病毒量［11］。以测定TCID50为基础的终点稀释法根据光镜下观察接种病毒细胞单层上CPE的出现判定病毒的感染［7］。CPE是病毒在细胞内增殖及其对细胞产生损害的最明显的表现，因此可作为病毒感染细胞确切、直观的证据之一。然而当病毒浓度降低时，CPE程度减弱，细胞形态特征变化不明显。而且感染性病毒液中潜在的细胞毒性因子和环境因素作用于细胞导致的病变可能被误判为由病毒引起的CPE，同时正常细胞在培养数日之后，老化状态不好也会出现类似CPE一样的细胞变圆现象［5］。因此，CPE的判断需要操作者具备一定经验，可能会产生人为偏差，降低了精确度。本文采用免疫细胞化学法测定被LCDV感染FG细胞的细胞质呈现红色，未被感染细胞的细胞质不着色，经苏木精复染后，细胞核呈现蓝色，结果对比明显，易判断，提高了检测的准确性和效率。

基于抗原抗体反应的免疫细胞化学法借助相应的已知免疫血清或抗体可用来测定组织细胞内病毒［21］，被应用于流行性乙型脑炎病毒、登革热病毒等病毒的滴度测定［15］。本文将免疫细胞化学法应用于LCDV的滴度测定，利用3株针对不同抗原决定簇的抗LCDV单克隆抗体的混合物作为第一抗体检测FG细胞内LCDV，可以特异结合较多的病毒蛋白抗原结合位点，以得到较强的阳性反应。另外，生物素－亲合素反应系统的引入，通过生物素偶联的马抗小鼠IgG第二抗体与碱性磷酸酶标记链亲合素之间的强亲合作用和多价反应性检测分析感染细胞中的病毒蛋白，提高了感染细胞的检出率。免疫细胞化学法可检测到2－8LCDV感染FG细胞后少量细胞中病毒的存在，而2－8LCDV感染120h后的FG细胞未观察到CPE现象。相对于终点稀释法，免疫细胞化学法更加灵敏。

［1］ Lang T.Lymphocystis disease in flatfish［M］.Diseases and Parasites of Flounder in the Baltic Sea.Turku，Finland：BMB Publications，1994：9－16.

［2］ Walker R，Weissenberg R.Conformity of light and electron microscopic studies on virus particle distribution in lymphocystis tumor cells of fish［J］.Ann N Y Acad Sci，1965，126（1）：375－85.

［3］ Midlige F H JR，Malsberger R G.In vitro morphology and maturation of lymphocystis virus［J］.J Virol，1968，2（8）：830－835.

［4］ Iwamoto R，Hasegawa O.Isolation and characterization of the Japanese flounder（Paralichthys olivaceus）lymphocystis disease virus［J］.J Aquat Anim Health，2002，14：114－123.

［5］ Zhang Q Y，Ruan H M，Li Z Q，et al.Infection and propagation of lymphocystis virus isolated from the cultured flounder Paralichthys olivaceus in grass carp cell lines［J］.Dis Aquat Org，2003，57：27－34.

［6］ 孙修勤，洪旭光，张进兴，等.牙鲆淋巴囊肿病毒在牙鲆鳃细胞系FG－9307中的增殖［J］.高技术通讯，2002，12：94－96.

［7］ 张安宁，刘晓林，李淑云，等.微量板细胞病变法滴定水痘疫苗的研究［J］.微生物学免疫学进展，2009，37（2）：26－29.

［8］ 文喻玲，尹兴晓，李传印，等.轮状病毒感染细胞蚀斑纯化及感染性滴度测定［J］.中华现代内科学杂志，2008，5（2）：97－99.

［9］ 周康凤，姜立民，黄海鹰，等.间接荧光免疫检测狂犬病病毒感染性滴度的可行性研究［J］.国际流行病学传染病学杂志，2006，33（6）：365－367.

［10］ Counihan N A，Daniel L M，Chojnacki J，et al.Infrared fluorescent immunofocus assay（IR－FIFA）for the quantitation of noncytopathic and minimally cytopathic viruses［J］.J Virol Methods，2006，133：62－69.

［11］ Villar L M，Amado L A，Gaspar A M C.In situ enzyme immunoassay for titration of a Brazilian hepatitis A virus strain（HAF－203）［J］.Braz J Med Biol Res，2004，37（7）：1023－1027.

［12］ Svensson L，Hjalmarsson A，Everitt E.TCID50determination by an immuno dot blot assay as exemplified in a study of storage con－ditions of infectious pancreatic necrosis virus［J］.J Virol Methods，1999，80：17－24.

［13］ 徐鹏，张佑红，杨益，等.流式细胞术快速检测杆状病毒滴度［J］.武汉工程大学学报，2001，32（1）：57－60.

［14］ 马海燕，方或聃，张敬之.应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率［J］.生命科学研究，2009，13（5）：394－398.

［15］ Borisevich V，Nistler R，Hudman D，et al.A highly sensitive and versatile virus titration assay in the 96－well microplate format［J］.J Virol Methods，2008，147：197－205.

［16］ LaBarre D D，Lowy R J.Improvements in methods for calculating virus titer estimates from TCID50and plaque assays［J］.J Virol Methods，2001，96：107－126.

［17］ Reed L J，Muench H.A simple method of estimating fifty per cent end points［J］.Am J Hygiene，1938，27：493－497.

［18］ Tong S L，Li H，Miao H Z.The establishment and partial char－acterization of a continuous fish cell line Fg－9307from the gill of flounder Paralichthys olivaceus［J］.Aquaculture，1997，156：327－333.

［19］ Cheng S F，Zhan W B，Xing J，et al.Development and characterization of monoclonal antibody to the lymphocystis disease virus of Japanese flounder Paralichthys olivaceus isolated from China［J］.J Virol Methods，2006，135：173－80.

［20］ 马广勇，吕宏旭，林晓婷，等.牙鲆淋巴囊肿病毒在体外培养细胞中感染循环的初步研究［C］.浙江，舟山：第一届海洋生物高技术论坛论文集，2003：197－204.

［21］ Xing J，Zhan W B，Zeng X H，et al.Detection of lymphocystis disease virus infection to flounder gill cells in vitro by monoclonal antibodies［J］.High Technol Letters，2006，12（1）：103－108.

［22］ 杨琴，张兴晓，杨灵芝.3种细胞培养流感病毒的比较［J］.动物医学进展，2009，30（11）：76－79.

Development of a Virus Titration Assay for Lymphocystis Disease Virus by an Immunocytochemical Staining Method

SONG Jia－Lei，SHENG Xiu－Zhen，ZHAN Wen－Bin

（The Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

An immunocytochemical staining method was developed for virus titration assay of lymphocystis disease virus（LCDV）in cultures of a flounder gill（FG）cell line.FG cells were propagated into a 48 well tissue culture plate and post inoculated with two－fold serially diluted LCDV，purified from lymphocystis cells of Japanese flounder Paralichthys olivaceus.After infection，the cell cultures were fixed and incubated with LCDV－specific monoclonal antibody in combination with biotin－avidin system.Infected cells and uninfected cells，stained with alkaline phosphatase substrate，could be differentiated by presence and absence of red color in the cytoplasm.Each positive well was scored microscopically based on the appearance of immunostained cells and the titer of the LCDV infectivity in FG cells was measured to be 1.77×210TCID50per mL by the immunocytochemical staining method.The immunocytochemical staining method is proved to be accurate and sensitive for measuring the titer of LCDV.

lymphocystis disease virus；flounder gill cells；TCID50；immunocytochemical staining method

R446.63

A

1672－5174（2012）05－055－05

国家自然科学基金项目（31172429；31072232）；国家高技术研究发展计划项目（2006AA100306）资助

2011－01－19；

2011－04－18

宋佳蕾（1986－），女，硕士生，主要从事水产病害与免疫学研究。

＊＊通讯作者：Tel：0532－82032284；E－mail：xzsheng＠ouc.edu.cn

责任编辑 王 莉