新型抗菌蛋白天蚕素-人溶菌酶在大肠杆菌中的表达条件优化及纯化

卢雪梅，金小宝，朱家勇

(1.广东药学院 药用生物活性物质研究所，2.广东省生物活性药物研究重点实验室，广东 广州 510006)

新型抗菌蛋白天蚕素-人溶菌酶在大肠杆菌中的表达条件优化及纯化

卢雪梅1，2，金小宝1，2，朱家勇1，2

(1.广东药学院 药用生物活性物质研究所，2.广东省生物活性药物研究重点实验室，广东 广州 510006)

目的 探讨重组家蝇天蚕素-人溶菌酶(Mdc-hly)在大肠杆菌中的表达条件及纯化。方法 利用SDSPAGE电泳和BandScan凝胶电泳图像分析系统研究诱导温度、诱导时机、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响。融合蛋白经His琼脂糖柱亲和色谱纯化后，Western blot鉴定。结果 在起始菌浓度为A600=0.6时加入浓度为1.0 mmol/L的IPTG，37℃诱导6 h，融合蛋白的表达量最高，占菌体总蛋白的39.1%。纯化后融合蛋白纯度可达95%，Western blot鉴定为目的蛋白。结论 确定了重组融合蛋白的最佳表达条件，并纯化了目的蛋白。

家蝇天蚕素;溶菌酶;重组融合蛋白;表达条件;纯化

由于环境的改变和微生物的适应性进化，细菌耐药性已成为影响公众健康的严重问题，人们不断地去研究、开发新型抗菌药物来对付耐药菌，其中肽类抗菌物质如溶菌酶、天蚕素等成为近年研究热点。溶菌酶可以破坏细菌细胞壁，对革兰阳性菌具有较强的杀菌活性［1］。天蚕素是一类具有广谱抗菌活性的抗菌肽，主要作用于细菌的细胞膜［2-4］。虽然溶菌酶、天蚕素等在耐药性问题日益严重的情况下显示出了良好的应用前景，然而与传统抗生素相比，目前所发现的肽类抗菌物质抗菌活性还不够理想，如天蚕素类抗菌肽对不同细菌的杀灭能力并非完全相同;溶菌酶的抗菌谱还不广泛，若单独使用对革兰阴性菌的抑制作用并不明显等。研究发现天蚕素能显著加强溶菌酶抗菌活性 ，推测可能是天蚕素破坏细菌外膜后利于溶菌酶作用于细胞壁。因此，本课题组首次提出将家蝇天蚕素与人溶菌酶构建成新型抗菌融合蛋白的设想，期望二者作用机制得到互补，发挥其综合效应，从而降低细菌的耐药机率。

前期研究中，我们将家蝇天蚕素与人溶菌酶基因进行了融合，并成功构建了重组原核表达质粒［7］。在此基础上，本研究通过优化外源基因在大肠杆菌中表达的几个重要因素:诱导温度、诱导起始菌浓度、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)浓度和诱导时间，以期确立目的蛋白高效表达的最佳条件，并通过亲和色谱纯化目的蛋白，为进一步研究重组家蝇天蚕素-人溶菌酶(Mdc-hly)的生物学活性及产业化开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株

含有pET-32a/Mdc-hly的Escherichia coli BL21(DE3)，由本所构建并保存。

1.2 主要试剂

蛋白质分子质量标准，MBI生物公司;TEMED，北京鼎国生物公司;丙烯酰胺、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、咪唑、过硫酸胺，Sigma公司;HisTrap Kit，德国GE healthcare公司;6×His Tag小鼠单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG HRP标记的抗体，美国Pharmacia公司;DAB显色试剂盒，武汉博士德公司。

1.3 细菌培养

将含有pET32a/Mdc-hly的 E.coli BL21(DE3)接种于含100μg/mL氨苄西林的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑取单个克隆，接种于LB液体培养基5 mL中，37℃，170 r/min振荡培养12～16 h。

1.4 不同诱导温度对目的蛋白表达量的影响

以1%接种量将过夜培养菌液接种于含100 μg/mL氨苄西林的LB培养基中，37℃振荡培养至A600在0.6左右，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，诱导温度分别为37，34，31和28℃。诱导培养6 h后离心，收集菌体进行SDS-PAGE，BandScan凝胶电泳分析系统分析目的蛋白的表达量。

1.5 诱导时机对目的蛋白表达量的影响

细菌培养方法同1.3项，分别在起始菌浓度A600为 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 和 2.0 时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，37℃诱导培养6 h，取样进行SDS-PAGE，BandScan凝胶电泳分析系统分析目的蛋白的表达量。

1.6 不同浓度IPTG对目的蛋白表达量的影响

细菌培养方法同1.3项，当A600为0.6时，分别加入 IPTG 至终浓度为 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 和1.2 mmol/L，37℃诱导培养6 h后，取样进行SDSPAGE，BandScan凝胶电泳分析系统分析目的蛋白的表达量。

1.7 不同诱导时间对目的蛋白表达量的影响

细菌培养方法同1.3项，当A600在0.6时，加入IPTC 至终浓度为1.0 mmol/L，37 ℃振荡培养2，4，6，8，10和12 h。离心收菌，取样进行SDS-PAGE，Band-Scan凝胶电泳分析系统分析目的蛋白的表达量。

1.8 融合蛋白的纯化与鉴定

将诱导表达的培养物离心，收集菌体加入细菌裂解液重悬菌体，冰浴超声破菌，离心收集沉淀。用包涵体溶解液(50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，含尿素8 mmol/L，pH 8.0)溶解，离心取上清。由于诱导表达的目的蛋白带有6×His标签，能与HisTrapTMHP亲和色谱柱上6×His配体特异性结合而挂在柱子上，其他杂蛋白不能与亲和色谱柱结合而穿透，从而达到分离纯化的效果。按照HisTrapTMHP说明书操作，吸取上清过预平衡后的亲和柱，洗去结合的非特异性蛋白，再分别用含100，300，500 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱目的蛋白，分段收集洗脱液，取样进行SDS-PAGE。

纯化产物经15%SDS-PAGE蛋白电泳后，通过半干电转仪转印至PVDF(Polyvinylidene difluoride)膜上，5%脱脂牛奶封闭液中室温封闭2 h，TBST漂洗(10 min×3)后放入用TBST按1∶1 000稀释的鼠源抗6×His一抗溶液中，4℃过夜，TBST漂洗(10 min×3)后，与 HRP标记的山羊抗小鼠 IgG抗体(1∶2 000)室温孵育1 h，用DAB显色系统显色，检测分析Western blot结果。

2 结果

2.1 不同诱导温度对目的蛋白表达量的影响

15%SDS-PAGE检测结果显示在约38 kD(因载体pET32a具有Trx标签蛋白，分子质量约为18 kD，而Mdc-hly分子质量约为20 kD，因此表达的蛋白应是大约38 kD)处出现蛋白条带，而未诱导的培养物中未出现特异性条带。在37，34，31和28℃诱导条件下，均有目的蛋白表达，目的蛋白表达量分别为细菌总蛋白的 38.1%，36.2%，30.7% 和 27.6%，可见37℃时，目的蛋白的表达量最高(图1)。

2.2 诱导时机对目的蛋白表达量的影响

菌体浓度 A600为 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 和 2.0时，目的蛋白表达量分别为细菌总蛋白的30.1%，33.9%，38.5%，38.4%，35.2% 和 33.6%。可见在其它条件相同的情况下，以A600值为0.6时开始诱导表达效果最好(图2)。

图1 诱导温度对表达产物的影响Fig.1 Effect of temperature on the expression level in E.coli BL21/pET-32a-Mdc-hly

图2 不同菌密度A600对表达产物的影响Fig.2 Effect of cell density on the expression level in E.coli BL21/pET-32a-Mdc-hly

2.3 不同IPTG诱导浓度对目的蛋白表达量的影响

IPTG 终浓度为 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 和 1.2 mol/L时，目的蛋白表达量分别为细菌总蛋白的18.7%，26.5%，32.6%，36.7%，38.7% 和 37.2%。可见IPTG在较低浓度时就可启动目的基因的高效表达，且目的蛋白表达量随着IPTG浓度的升高而升高，浓度为1.0 mmol/L时表达量最高;而IPTG浓度提高到1.2 mmol/L时，表达量反而有所下降(图3)。

2.4 不同诱导时间对目的蛋白表达量的影响

诱导时间为2，4，6，8，10 和 12 h 时，目的蛋白表达量分别为细菌总蛋白的 31.7%，36.5%，39.1%，38.9%，38.4% 和 37.4%。可见目的蛋白的表达量随诱导时间的增加而逐渐增加，至6 h时目的蛋白表达量最高(图4)。

图3 IPTG浓度对表达产物的影响Fig.3 Effect of IPTG concentration on the expression level in E.coli BL21/pET-32a-Mdc-hly

图4 诱导时间对表达产物的影响Fig.4 Effect of post-induction timing on the expression level in E.coli BL21/pET-32a-Mdc-hly

2.5 融合蛋白的纯化与鉴定

纯化洗脱液经15%SDS-PAGE蛋白电泳，结果见图5，BandScan软件分析结果显示500 mmol/L咪唑溶液洗脱可得到纯度为95%的融合蛋白。Western blot分析结果显示，在分子质量为38 kD处有一特异清晰条带，而未诱导对照则没有(图6)，说明本研究成功地表达纯化了目的蛋白，且在此过程中融合蛋白没有发生降解现象。

3 讨论

肽类抗菌物质至今未能得到广泛应用，主要原因之一是其来源困难，无法大量低成本获得。天然提取资源有限，工艺复杂，成本昂贵;化学合成肽类则成本太高，产业化困难;通过基因工程技术表达成本较低的抗菌活性蛋白则是国内外学者追求的可持续手段。大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，应用最为广泛的经典表达系统，是生物技术研究和生物药物产业化进程中的重要工具。优化表达条件的主要目的是尽可能提高目的蛋白的表达量，降低生产成本。但是外源基因在宿主菌中高效表达，必然影响细菌本身的生长和代谢，而细菌代谢受到影响又必然反过来影响外源基因的表达。如何合理地调节好宿主菌的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达不可缺少的一个环节。

在本研究中，我们采用了宿主菌的生长与诱导分阶段进行，在诱导阶段采用ITPG的诱导措施。影响外源蛋白表达的因素很多，除了质粒和宿主菌的因素外，培养条件(如诱导温度、诱导菌体起始浓度、诱导剂浓度、诱导时间)也至关重要，通过对这些因素的优化，可以提高目的蛋白的产量。由本研究可知，优化培养条件可以有效提高目的蛋白的表达量，在最适宜的条件(诱导温度为37℃、起始菌浓度为 A600=0.6、IPTG 浓度为 1.0 mmol/L、诱导时间为6 h)下，融合蛋白占全菌总蛋白的39.1%。

亲和色谱是指利用蛋白质、多肽与某些配基的特异性相互作用而进行分离。本研究选用的融合蛋白表达系统，表达的目的蛋白带有6个组氨酸残基可以特异性地结合固定化金属离子Ni2+，所以可用严格的条件轻易的洗掉杂质;而目标蛋白可通过咪唑的竞争被温和的洗脱。此外，这种相互作用不受蛋白质三级结构的影响，所以即使在溶解包涵体所需的强变性条件下也能进行带6×His标签的目标蛋白纯化。本研究采用HisTrapTMHP亲和色谱柱对融合蛋白对行纯化，并对纯化条件进行了初步探索，获得了一定量纯度较高的目的蛋白，这为进一步研究新型抗菌融合蛋白Mdc-hly的生物学活性及产业化开发奠定了必要的基础。

图5 融合蛋白纯化的SDS-PAGE分析Fig.5 Purification of fusion protein

图6 融合蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot of fusion protein

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［7］卢雪梅，金小宝，朱家勇，等.融合基因Mdc-hly的构建及原核表达［J］.生物技术通报，2010(4):150-155.

Optimization of expression conditions and purification of new antibacterial protein Mdc-hly in Escherichia coli

LU Xue-mei1，2，JIN Xiao-bao1，2，ZHU Jia-yong1，2
(1.Institute of Pharmaceutical Bioactive Substances of Guangdong Pharmaceutical University，2.Guangdong Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，Guangzhou 510006，China)

Purpose To optimize the expression conditions of recombinant Musca domestica cecropinhuman lysozyme(Mdc-hly)and to purify recombinant protein.Methods Recombinant E.coli strains BL21(DE3)with plasmid pET-32a/Mdc-hly were induced at various temperatures，and various cell density with IPTG at different concentrations for different hours.Expressed protein was purified by chromatographic column and identified by Western blot.Results The expression level of fusion protein reached a peak value，accounting for 39.1%of the bacterial total protein，after the recombinant E.coli was induced with 1.0 mmol/L IPTG at 37 ℃，A600=0.6 for 6 h.SDS-PAGE and Western blot analysis indicated that the recombinant protein could be purified to 95%homogeneity.Conclusion The conditions for expression of fusion protein were preliminarily optimized，and the expressed protein was purified.

Musca domestica cecropin;lysozyme;recombinant fusion protein;expression condition;purification

Q786

A

1005-1678(2012)04-0329-04

2012-02-08

国家自然科学基金资助项目(30671832)

卢雪梅，女，硕士，助理研究员，研究方向:药用生物活性物质结构功能与应用研究，Tel:020-39352552，E-mail:luxuemei605@163.com;朱家勇，男，通信作者，教授，博士生导师，E-mail:zhujy@gdpu.edu.cn。