碘标锰卟啉及其小鼠体内分布

刁 尧，刘新宁，官文征，赵文瑾，刘 洁，赵 恂，于成国

1.中国医科大学 实验技术中心，辽宁 沈阳 110001；2.阜新市第二人民医院，辽宁 阜新 123000；3.中国医科大学 第94期临床医学七年制英文班，辽宁 沈阳 110001

锰5,10,15,20-(4-苯甲酸)卟啉[ Mn(Ⅲ)tetrakis(4-benzoic acid)porphyrin chloride(MnTBAP)]，分子式 C48H28ClMnN4O8，相对分子质量879.2，分子结构式示于图1。常温下MnTBAP为黑色晶体。MnTBAP是以卟啉环为配体的大环类SOD模拟物和广谱的游离基清除剂，它同时具有SOD和过氧化氢酶(catalase,CAT)的特性[1]。文献报道MnTBAP具有抗炎、抗氧化、抗自由基损伤、保护肝脏、神经损伤等作用[2-6]。虽然MnTBAP的药效涉及很多方面，但其在生物体内的具体代谢和分布行为的报道较少，这妨碍了对MnTBAP相关药效的更深入研究。本研究拟采用灵敏的放射性示踪法分析MnTBAP在小鼠体内的分布特点，以揭示其主要的代谢方式。

图1 MnTBAP的分子结构式

1 实验部分

1.1 主要材料

MnTBAP，Calbiochem公司，纯度大于95%；Na131I，中国原子能科学研究院；Iodogen，Sigma公司；KM小鼠(SYXK(辽)2008-0005)，中国医科大学实验动物中心；FJ-2008PS型γ计数仪，西安核仪器厂；PMI 170-9400磷屏成像仪，美国Bio-Rad公司；聚酰胺薄膜，国药集团化学试剂有限公司；其它试剂为国产分析纯。

1.2 131I-MnTBAP的制备

采用Iodogen法对MnTBAP进行131I标记。标记管中预先涂以 Iodogen 50 μg，向标记管中依次加入50 μL MnTBAP样品(1 g/L，二甲基亚砜(DMSO)溶解)、10 μL 18.5 MBq Na131I，振荡反应10 min，以生理盐水溶解，放置备用。以聚酰胺薄膜为支持介质，生理盐水为展开剂，测定其标记率和放化纯度。

1.3 131I-MnTBAP标记化合物放化纯度的鉴定

采用薄层层析法，吸取碘化反应液2 μL，在距聚酰胺薄膜薄层层析板底端1 cm处点样，游离131I-作为对照点样，点样直径0.2 cm，冷风吹干。生理盐水为展开剂，上行展开，131I-MnTBAP的Rf=0～0.1，游离的131I-的Rf=0.9。展开结束后晾干，磷屏成像仪成像，然后分段剪取聚酰胺层析板，经γ放免计数仪测量放射性计数，计算标记率、放化纯度和放射性比活度。标记物的标记率(%)=(131I-MnTBAP的放射性计数/点样量总放射性计数)×100；比活度(Bq/μg)=(放射性核素投入量×标记率)/投入的MnTBAP总量。

1.4 131I-MnTBAP标记化合物的纯化

采用薄层层析法，聚酰胺薄膜薄层层析板，6 cm×20 cm，距底边1.5 cm处铅笔画线设为原点，点样直径为0.2 cm，冷风吹干。生理盐水为展开剂，上行展开。晾干，磷屏成像仪成像，根据已知的Rf值，在原点处刮下聚酰胺粉末(吸附有131I-MnTBAP)置于清洁玻璃小瓶中，DMSO溶解，反复多次，真空泵吹干标记物附着于管壁，DMSO助溶，取2 μL进行薄层层析，进行放射化学纯度鉴定。

1.5 131I-MnTBAP 标记化合物的体外稳定性实验

取50 μL纯化后的标记物分别加入到100 μL以下2种体系中：生理盐水、新鲜人血清。在37 ℃下贮存，分别于2、24、48 h取样，聚酰胺薄膜层析测定放化纯度，观察标记物的稳定性。

1.6 131I-MnTBAP的小鼠体内分布

42只KM小鼠(约20 g，4周龄)随机分为7组(n=6)，各组每只鼠经尾静脉注射200 μL131I-MnTBAP(每只约185 kBq)，各组小鼠分别于注射后5、10、30、60、120、240、1 440 min断头处死，取心、肝、脾、肺、肾、肌肉、骨骼、胃、肠、生殖腺、脑、脊髓、甲状腺、颌下腺、血，称重，测各个样品放射性计数，计算每克组织放射性摄取占注入量的百分率(%ID/g)。

1.7 统计方法

实验数据以x±s表示，结果采用t检验。

2 结果

2.1 131I-MnTBAP的标记率及稳定性

在以聚酰胺薄膜为支持介质、生理盐水为展开剂的体系中，131I-MnTBAP的Rf=0～0.1，游离的Na131I的Rf=0.9。经测定，131I-MnTBAP的标记率达96.3%，放射性浓度为57.45 GBq/L，比活度为0.36 TBq/g。

2.2 131I-MnTBAP的体外稳定性

131I-MnTBAP在不同体系中、37 ℃下的稳定性结果示于图2。由图2可以看出，标记物在人血清和生理盐水2种体系中，37 ℃下放置48 h，标记物的放化纯度仍大于90%，表明标记物在37 ℃下体外稳定性较好。由131I的标记位点分析，131I可能标记在Mn(Ⅲ)上，即取代Cl或配位于Cl的对位。131I-MnTBAP薄层层析放射性分布图示于图3。

图2 131I-MnTBAP的体外稳定性

图3 131I-MnTBAP薄层层析示意图

2.3 131I-MnTBAP小鼠体内分布

动物实验结果列于表1。表1结果表明，静脉注射给药后131I-MnTBAP在体内分布广泛。血中清除较快，注射后5 min时即达峰值，其放射性摄取为5.55%ID/g；肝、肾和肺中分布较高，注射后5 min时其放射性摄取分别为8.34%ID/g、12.23%ID/g、6.75%ID/g，而后缓慢下降，注射后4 h时分别为0.34%ID/g、0.73%ID/g、0.13%ID/g，表明131I-MnTBAP在体内主要经肝、肾代谢；131I-MnTBAP在脑和脊髓中分布较少，注射后5 min时其放射性摄取均为0.11%ID/g；甲状腺内的放射性随时间的延长而逐渐增加，甲状腺与血液的放射性摄取比值由静脉注射131I-MnTBAP后5 min时的1.5倍升至240 min时的14倍，与时间基本呈线性关系。

3 讨 论

MnTBAP药理作用广泛，主要有抗炎、抗氧化、抗自由基损伤、保护肝脏、肺脏及脑、脊髓组织氧化损伤等作用[7-9]。它是一种新兴的、稳定的相对分子质量较小的新型非肽类SOD模拟分子，克服了传统SOD的缺陷，具有以下的优点：(1)它同时具有SOD和过氧化氢酶(catalase,CAT)的特性；(2)相对分子质量小，具有细胞渗透性，易于透过细胞膜进入细胞内部(如线粒体或微粒体等部位)；(3)不具有免疫原性而不会引起机体的免疫反应；(4)体内稳定，不发生分解代谢并可随着尿液排出,无明显毒副作用[10-12]。

本实验制备的131I-MnTBAP标记物体外稳定性实验结果显示，标记后48 h的放化纯度维持在90%以上(溶于新鲜人血清中)，适于MnTBAP在体内外的微量示踪研究，为下一步研究提供了可靠保障。利用131I-MnTBAP具有灵敏准确的放射性示踪特点，可用于观察分析其在整体生物体内的代谢过程和可能的作用靶点。

分布实验的结果显示，静脉注射给药后131I-MnTBAP在体内广泛分布，主要分布于肝、肺、肾，其中，以肾脏分布最多，肝、肺次之，说明肝、肺脏对MnTBAP具有很高的摄取率，肾脏是其主要的代谢脏器，此结果提示131I-MnTBAP可为MnTBAP保护肝、肺脏的研究提供一个灵敏的分析方法。MnTBAP在脑、脊髓中分布较少，揭示其难于透过血脑屏障(BBB)，与文献报道一致[13]。

表1 131I-MnTBAP在小鼠体内的生物分布

注(Note):n=6

131I-MnTBAP在甲状腺内的放射性随时间的延长而逐渐增加，反映出其在体内有一个渐进性的脱碘过程；同时体外稳定性实验结果也显示其在生理盐水中不够稳定，从分子结构分析，其分子结构存在的苯甲酸基及卟啉环结构使得整个分子极性较大而脂溶性较少，这是分子难于透过BBB的重要原因之一，也是其在生理盐水中不稳定的原因之一，因此，在体内生理条件下可能易脱碘而不稳定，所以本实验采用DMSO溶解效果较生理盐水好。

碘标的MnTBAP能灵敏地反映其在小鼠体内的基本代谢过程，可进一步结合其它分子生物学技术分析其在体内精确的代谢行为及可能的作用机制。

致谢：感谢中国医科大学实验技术中心崔泽实教授在磷屏成像仪应用上给予的支持和帮助。

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