3个金银花新品种逆境条件下脯氨酸含量初步分析

蔡 能 ， 王晓明 ,3，曾慧杰 ，李永欣

(1.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004；2.湖南省林木无性系育种重点实验室，湖南 长沙 410004；3.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004)

3个金银花新品种逆境条件下脯氨酸含量初步分析

蔡 能1,2， 王晓明1,2,3，曾慧杰1,2，李永欣1,2

(1.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004；2.湖南省林木无性系育种重点实验室，湖南 长沙 410004；3.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004)

通过干旱、低温、水分胁迫处理，测定了3个金银花新品种金翠蕾、银翠蕾、白云的相对含水量、脯氨酸含量等指标，结果表明：干旱胁迫下，脯氨酸含量先升高后降低，金翠蕾含量最高，抗旱性最强，其次是银翠蕾，白云抗旱性最弱；水淹胁迫下，白云体内脯氨酸含量上升最快，峰值最大，抗涝性最强，金翠蕾和银翠蕾抗涝性弱于白云，抗涝程度大致一致；冷冻条件下，金翠蕾离体叶片积累更多脯氨酸，抗寒性最强，其次为银翠蕾，白云抗寒性最弱。

金银花；脯氨酸；抗旱性；耐涝性；抗寒性

金银花是一种具保健、药用、观赏及生态功能于一体的经济植物，也是国务院确定的名贵中药材之一。湖南省林业科学院从灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides中选育出高产、优质的花蕾型金银花‘金翠蕾’、‘银翠蕾’和‘白云’3个优良新品种，干花产量比普通种高出130.9%～172.0%，干花绿原酸含量比普通种高出34.64%～60.97%，并具较强的抗病虫能力和适应性，经济效益显著，各地引种兴趣高涨。但是，近年来随着全球气候环境恶化，干旱、洪涝、霜冻等自然灾害天气发生频率越来越高，对其抗逆性进行研究变得尤为重要，这将为扩大其栽培种植范围、研究配套栽培技术提供科学依据。

植物在受到逆境胁迫时会表现出各种不同的性状，严重时将导致死亡，具体表现为其体内一些酶和渗透调节物质的变化。通常可通过测量植物体的细胞膜透性、过氧化物酶(POD) 活性、游离脯氨酸含量等生理指标了解植物体受迫害程度, 从而得知植物体忍受逆境胁迫的最大能力，有助于探讨其在不同的生长环境条件下进行配置应用[1]。其中，逆境胁迫下植物体内游离脯氨酸含量及其变化是衡量植物抗逆性的重要指标，因此本研究以干旱、水涝、冰冻条件下3个新品种的脯氨酸含量为分析对象，旨在研究3个金银花新品种对逆境条件的反应与耐受能力，为其适应性栽培和大面积推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为灰毡毛忍冬新品种‘金翠蕾’、‘银翠蕾’、‘白云’营养钵苗，苗高大约15 cm，营养钵9 cm×9 cm。试验时间为5～8月。

1.2 研究方法

1.2.1 胁迫处理方法

（1）干旱处理

在温室大棚内，采用自然干旱法，先用水浇透土壤，后让其自然干旱，将干旱处理当天记为第1天，测量脯氨酸含量，以后每2天测量1次。

（2）低温处理

取当年生新梢叶分别置于0、-10、-20、-30℃低温冰箱中处理24 h，分别测量脯氨酸含量。

（3）水淹处理

选择生长一致的植株在大棚水池内进行水淹处理，每个品种5 株，水深与盆内土表高度相齐，将处理当天记为第1天，测量脯氨酸含量，以后每2天测量1次。

1.2.2 离体叶的相对含水量和水分饱和亏缺的测定

参照陈建勋[2]、Lu[3]、侯福林[4]等人的研究方法进行。剪下叶片后立刻称鲜质量(WF)，然后将它们放在烧杯中，用蒸馏水浸泡24 h，拭去叶片表面水分，称饱和质量(WSF)，之后于鼓风烘箱中80℃烘干48 h，称干质量(WD)。3次重复，取平均值，计算该次取样植物叶片的相对含水量。

相对含水量（RWС，CRWС，%）：

水分饱和亏缺(WSD，WWSD，%)：

1.2.3 离体叶片水分的测定

取各品种相同部位的10片离体鲜叶分别称鲜质量(MF)，然后在温度30℃、湿度73%条件下进行风干，每隔1 h测定叶片质量，连续测定，直至叶片质量基本无变化，以此质量作为叶片失水后的质量(MD)。失水率（R,%）公式为：

1.2.4 游离脯氨酸的测定

参照侯福林和李合生的方法[4-5]。脯氨酸标准曲线：在1～10 µg/mL 脯氨酸浓度范围内制作标准曲线。取标准溶液各2 mL，加入2 mL 3%磺基水杨酸、2 mL 冰乙酸、4 mL 2.5%茚三酮溶液，置沸水浴中显色60 min，冷却后，加入4 mL甲苯萃取红色物质。静置后，取甲苯相测定520 nm波长处的吸收值（以甲苯为空白对照），依据脯氨酸量和相应吸收值绘制标准曲线。

游离脯氨酸的提取: 称取约0.3 g叶片鲜样（来自经冷冻处理），剪碎后放入具塞试管中，加5 mL 3%磺基水杨酸溶液，加塞后在沸水浴中提取10 min，过滤液待测。

游离脯氨酸的测定: 取提取液2 mL于具塞试管中，加入2 mL蒸馏水、2 mL冰醋酸和3 mL酸性茚三酮试剂，摇匀后在沸水浴中加热显色2 h，取出后冷却至室温，加入5 mL甲苯，充分摇匀以卒取红色产物。静置约10 min，吸取甲苯层，于分光光度计520 nm波长处测定吸光度。

计算样品中的脯氨酸含量:

式中：C为脯氨酸含量（μg/g）；C0为由标准溶液求得脯氨酸μg数；V为提取液总体积（mL）；A为测定液总体积（mL）；W为样品质量（g）。

2 结果与分析

2.1 离体叶的相对含水量和水分饱和亏缺

相同条件下，金翠蕾相对含水量最高，达到92.5%，白云相对含水量最低，为80.73%；金翠蕾水分亏缺最小，为7.50%，白云水分亏缺最大，为19.27%；金翠蕾失水率最低，为62.18%，白云失水率最高，为74.11%；银翠蕾的相对含水量、水分亏缺和失水率均处于两者之间（见表1）。从这3组数据分析，金翠蕾植株体内含水量较高，对水的需求相对较小，更难失水，因此，金翠蕾抗旱性最强，银翠蕾次之，白云最弱。

表1 3个品种的相对含水量、水分饱和亏缺和失水率Table 1 RWC,WSD and water loss rate of 3 cultivars

2.2 干旱胁迫下脯氨酸含量变化

金翠蕾、银翠蕾、白云在干旱胁迫过程中脯氨酸含量变化趋势大致相同，先扬后抑。干旱胁迫初期，随着干旱胁迫的加强，脯氨酸含量升高。当干旱胁迫第5天时，脯氨酸含量急剧上升；第7天，脯氨酸含量最高，达到峰值，3个品种平均为28.33 μg/g，其中金翠蕾中脯氨酸含量最高，为33.53 μg/g，比银翠蕾、白云分别高出17.36%和46.55%；7 d后，脯氨酸含量又开始下降，第11天时达到最低点，3个品种平均为6.82 μg/g（见图1）。金翠蕾、银翠蕾、白云在干旱胁迫过程中脯氨酸平均含量分别为18.89、15.32、12.83 μg/g，这进一步说明金翠蕾的抗旱性最强，银翠蕾次之，白云最弱。

图1 干旱胁迫下植株体内脯氨酸含量变化Fig. 1 Changes of proline contents of 3 cultivars after drought

在整个干旱胁迫过程中，从植株外部形态变化来看，干旱胁迫初期，3个品种均无明显变化；第7天，金翠蕾、银翠蕾、白云均开始出现黄叶现象；第9、11天，叶片开始脱水和枯萎。这与体内脯氨酸含量第7天达到最大值，随后又下降的变化趋势是一致的。

2.3 水淹胁迫下脯氨酸含量变化

水淹胁迫第1～3天，白云和银翠蕾体内脯氨酸含量下降，第3天开始上升，第5天后急剧上升，第7天达到峰值，分别为14.68 μg/g和12.83 μg/g；随后，随着水淹时间的延长，脯氨酸含量降低，银翠蕾第11天达到最低值（4.55 μg/g），而白云在第9天达到最低值（4.98 μg/g），随后略有升高，第11天升高到7.38 μg/g。水淹胁迫初期，金翠蕾脯氨酸含量降低较快，降低幅度较大，从最初的10.06 μg/g降到5.21 μg/g；当水淹胁迫第5天开始，脯氨酸含量才开始上升，第7天含量达到最高值（12.51 μg/g）后开始下降，第11天时达到最低点，为4.98 μg/g（见图2）。整个胁迫过程中，3个品种体内脯氨酸含量均在第7天达到最高值，其中白云、金翠蕾、银翠蕾的脯氨酸含量分别为14.68、12.51和12.83 μg/g，白云比金翠蕾和银翠蕾分别高出17.38%和14.42%；从3个品种在整个胁迫过程中的脯氨酸含量均值来看，白云也比金翠蕾和银翠蕾分别高出7.41%和11.97%。这说明抗涝性方面白云最强，而金翠蕾和银翠蕾较弱，且两者差异不大。

图2 水淹胁迫下植株体内脯氨酸含量变化Fig. 2 Changes of proline content of 3 cultivars after water-logging

从植株外部形态变化来看，水涝胁迫初期，3个品种均无明显变化；第7天开始，金翠蕾、银翠蕾叶片开始出现枯萎，第11天植株枯萎，而白云仍保持较好的生长势，抗涝能力仍较强。这也进一步说明3个品种中，白云抗涝性最强，金翠蕾和银翠蕾稍弱。第9天后，白云体内脯氨酸含量回升，说明白云细胞自我调节能力较强，水淹一段时间后逐步恢复活力，耐水淹时间较长。

2.4 低温胁迫下脯氨酸含量变化

低温（0℃）时，3个品种脯氨酸含量均较常温下高，平均值为64.16 μg/g。-10℃时，脯氨酸含量下降，平均值为52.57 μg/g；-20℃时，脯氨酸含量又上升，平均值达到64.14 μg/g，随后脯氨酸含量又下降；-30℃时，3个品种脯氨酸含量均低于0℃时的含量，平均值为49.75 μg/g（见图3）。3个品种中,金翠蕾脯氨酸含量始终保持最高，平均为65.20 μg/g，其次为银翠蕾，平均值57.22 μg/g，白云最低，平均值为50.55 μg/g，说明金翠蕾体内积累了更多的脯氨酸，以此来抵御冻害的影响。

图3 不同冷冻温度下离体叶片内脯氨酸含量Fig. 3 Proline contents in vitro of 3 cultivars after freezing in leaves

3 讨 论

植物相对含水量反映了植物在遭受水分胁迫后体内水分亏缺的程度，在干旱胁迫下，植物能维持较高的相对含水量，表明植株的叶片持水能力越强，抗旱性越强，因此，相对含水量是鉴定植物抗性行之有效的指标之一[6]。相对含水量与水分亏缺作为水分张力的两个指标，表示树木水分状况和抗旱性大小，水分亏缺越小，相对含水量越大，树木抗旱性越强。离体叶片失水率是评价叶片气孔开闭能力的自行调节以及叶表面角质层蒸腾作用强弱的一个重要指标。金翠蕾相对含水量最高，白云相对含水量最低；金翠蕾水分亏缺最小，白云水分亏缺最大；金翠蕾失水率最低，白云失水率最高；银翠蕾的相对含水量、水分亏缺和失水率均处于两者之间。从相对含水量、水分亏缺、失水率这三组数据分析，金翠蕾抗旱性最强，银翠蕾次之，白云最弱。

游离脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，在发生低温、干旱、盐渍等胁迫时，大部分植物均会积累大量的脯氨酸来保持细胞持水和生物大分子结构的稳定性，以适应逆境[7-10]，更重要的是对膜脂和蛋白起到保护作用，防止活性氧对膜脂和蛋白的过氧化作用[11]。

脯氨酸在干旱条件下的积累有利于增强组织的保水能力,使细胞保持一定的膨压,维持各种正常的生理活动。在逆境下脯氨酸含量变化的研究很多，但结果各异。很多材料说明植物的抗旱性与脯氨酸含量存在相关性。随着干旱时间的延长，植株体内脯氨酸含量呈上升趋势，这在万寿菊、棉花、茶树、黄刺玫、光皮树等植物上得到了很好的验证[12-18]。本研究中，脯氨酸含量先下降后上升，第7天达到最高后又下降，第11天最低；从外观上来看，7天后叶片开始变黄和萎蔫。这种先扬后抑的趋势与多花胡枝子、荆条、榛子、沟叶结缕草、假俭草体内脯氨酸含量变化规律一致[19-20]，这是由于随着干旱时间的进一步延长，植物组织发生萎蔫、碳水化合物供给不足、酶活性降低等原因，游离脯氨酸含量呈下降趋势。脯氨酸含量变化与形态外观综合评价，研究结果说明，脯氨酸含量与抗旱性具有紧密的联系，以游离脯氨酸含量高峰期出现的早晚及高峰期时的含量高低作为衡量抗旱性的标准是较为合理的。

同样，在水淹初期，脯氨酸积累量小，随淹水时间延长,植物体内的游离脯氨酸含量增加[21-22]。本研究中，水淹胁迫第7天，3个品种体内脯氨酸含量均达到最高值，随后降低，其中白云脯氨酸含量最高；从外部表型来看，第7天，金翠蕾、银翠蕾叶片开始出现枯萎，第11天植株枯萎，而第7天白云保持较好的生长势，抗涝能力仍较强。脯氨酸含量变化与形态外观综合评价，研究结果说明，脯氨酸含量与抗涝性具有紧密的联系，以游离脯氨酸含量高峰期出现的早晚及高峰期时的含量高低作为衡量抗涝性的标准是较为合理的。

脯氨酸作为植物细胞质的重要渗透调节物质，可反映植物对低温的适应能力和抵抗能力[23]。有关抗寒性的研究已证明，低温环境胁迫能刺激脯氨酸及其它氨基酸的合成及抑制其氧化降解，在低温寒冷环境中，许多植物体内的脯氨酸含量增加[24-25]，从而提高蛋白质的稳定性，增强植物的抗逆性和对低温寒冷的适应性[26-27]。

本研究中，0℃低温时，3个品种脯氨酸含量均较常温下高,说明低温胁迫下，植株体内积累大量脯氨酸来抵御寒冷；其中，金翠蕾脯氨酸含量高于银翠蕾和白云，说明其体内能积累更大量的脯氨酸，抗寒能力更强。

逆境胁迫对植物的影响是多方面的,逆境会破坏细胞膜结构的完整性,从而导致细胞膜选择性吸收的丧失和细胞内电解质的渗漏。细胞膜的这种改变又会影响到植物其它的生理活动,如引起叶绿素降解、丙二醛含量积累，还能诱发植物体产生过量的活性氧自由基,激起植物体内抗氧化酶的活性增强和渗透调节物质的增加,以避免受活性氧自由基的伤害。因此，植物对逆境胁迫的反应不仅表现在植株外部形态上，也表现在体内渗透调节物质（可溶性糖、脯氨酸、丙二醛等）含量和抗氧化酶（超氧化物酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶等）活性的变化。本研究对逆境条件下植株体内脯氨酸含量变化的分析还只是一项初步研究，要研究金银花的抗逆性，还必须从多方面入手，进行深入研究。

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Analysis on proline contents in 3 cultivars of honeysuckle under condition of stresses

СAІ Neng1,2, WANG Xiao-ming1,2,3, ZENG Hui-jie1,2, LІ Yong-xin1,2
(1. Hunan Academy of Forestry, Сhangsha 410004, Hunan, Сhina;2. Hunan Key Lab. of Trees Сlones Breeding Technology, Сhangsha 410004, Hunan, Сhina;3. Сentral South University of Forestry and Technology, Сhangsha 410004, Hunan, Сhina)

The relative water content, proline contentet al. in “Jincuilei” , “Yincuilei” and “Baiyun” which are 3 new cultivars ofLonicera macranthoideshave been determined, through treatments of under drought，water-logging and cold stresses. The results show that proline content fi rst increased and then showed a downward tendency under drought stress, “Jincuilei” showed high droughtresistant with highest Pro content, the order of drought tolerance from high to low was: “Jincuilei” ＞ “Yincuilei” ＞ “Baiyun”; proline content in “Baiyun” increased signif i cantly under water-logging stress, which indicated “Baiyun” had higher water-logging tolerance than “Jincuilei” and “Yincuilei”, which were similar in water-logging tolerance; Leaves in vitro of “Jincuilei” had higher proline content under cold and freezing, which indicated “Jincuilei” had higher cold tolerance, the order of cold tolerance from high to low was: “Jincuilei”＞ “Yincuilei” ＞ “Baiyun”.

honeysuckle; proline; drought tolerance; water-logging tolerance; cold tolerance

S789；Q945.78

A

1673-923X (2012)05-0161-05

2012-01-10

国家林业公益性行业科研专项 “金银花、厚朴优良新品种创制及利用技术研究”(201104023)；长沙市科技计划重点项目“抗甲流感金银花新品种选育及示范”(K1003313-21)

蔡 能(1977-)，女，湖南益阳人，助理研究员，主要从事木本药用植物遗传育种及生理生化相关研究；

E-mail：nengcai@163.com

[本文编校：谢荣秀]