揭秘化妆品安全性评价技术(四)

　　摘要：眼睛是最容易接触化妆品及其成分的器官之一，眼刺激性评价是化妆品原料及产品安全性评价的主要内容，传统眼部刺激试验采用实验动物进行，不仅外推到人具有一定的风险，而且造成动物极大的痛苦。近年来，多种替代动物试验的体外方法被开发和应用。
　　
　　在某些条件下，眼睛可能成为化妆品及其成分作用的靶器官或吸收途径，因而外源物质可能造成眼部的健康危害，这些可能发生的毒性作用包括：眼及外周组织的局部刺激、损伤和炎症反应，过敏反应，眼深部的组织损伤，临床表现为眼部疼痛、刺痛、灼热、眼睑眨动、泪液增多，严重者引起不同程度的功能性损失，如角膜浑浊、水肿、甚至视力下降。正常情况下，眼睛很少直接接触外源物质。但在化妆品使用过程中，通常由于意外使化妆品以稀释的形式进入眼睛（例如香波），产生刺激作用。眼刺激性是指眼睛前表面直接接触受试物后引起的眼及其周围粘膜可逆性炎性变化。眼腐蚀性是指眼睛前表面直接接触受试物后引起的眼及其周围粘膜不可逆性组织损伤。
　　
　　检测化学物的刺激性和腐蚀性的传统实验是由Draize等提出的兔眼实验，目前仍是测定急性眼毒性的国际标准。近年来，在动物福利的压力下，一些优化的试验方法被提出，并陆续被验证和认可。除了经验证认可的替代方法外（BCOP试验、ICE试验、IRE试验），大多数化妆品公司将一些所谓“有效（valid）”替代方法用于化妆品成品筛选。有效替代方法被定义为：还没有通过完整验证程序的技术，但存在足够多的科学数据证明其相关性和可靠性。这些方法包括HET-CAM测试、RBC试验及NRU试验。这些方法目前可作为危险识别的筛选工具，用于非风险评估过程。
　　
　　一、体内眼刺激的发生机制
　　体内眼刺激的发生机制表明，实验兔暴露受试物后最初几个小时（一般3小时）内，角膜的损伤程度可以预测眼睛损伤的持续时间和最终损伤程度。一般来说，轻度刺激物只影响表层角膜上皮，轻度和中度刺激物主要影响上皮和表层基质，严重刺激物能穿透更深的基质发挥作用，甚至可能是基质全部。而且损伤的可逆性和最初的损伤程度相关。
　　角膜损伤程度（细胞损伤）和大体观察两者之间的相关关系，对于开发和验证预测眼刺激性的体外/离体检测方法提供了机理性基础。在所有可能影响角膜损伤的动力学因素中，受试物的自身细胞毒性潜力排在第一位。那些可溶解细胞膜或者是导致蛋白质凝集的物质可立即产生细胞毒性，如表面活化剂和一些有机溶剂是这类物质的代表。那些作用于细胞能量代谢的物质也可快速产生作用，但可能没有第一类物质迅速。化学物质还可以通过对大分子的烷化或者其他影响而产生作用，这类物质的作用可能表现为一种迟发性的细胞毒性（如迟发性坏死或者凋亡）。
　　体内眼刺激实验中受试物局部接触角膜和结膜，而实际情况下暴露的持续时间并不确定，可能从几分钟到几小时不等。角膜细胞层的暴露深度取决于受试物渗透和锚定于表层的速度和能力。这样就很好理解产生明显细胞毒性所需的时间和细胞接触受试物后产生“损伤”所需的时间并不一致，而后者可能最终导致细胞死亡。那些快速损伤细胞的物质可能更容易对眼细胞产生毒性作用。
　　
　　二、动物实验及优化方法
　　动物试验是受试物直接接触动物结膜囊，随后通过肉眼仔细检查角膜，虹膜和结膜的变化，并量化评分，从而对生理反应做出分类。目前在不同的法规中有多种不同的评分系统，评价范围有最大单次组织计分和全部三种组织平均加权总分计分几种。对于化妆品的安全评估，加权总分、最大平均分(MAS)和改良最大平均分（MMAS，不包括接触受试物后1小时的结果）均在使用。
　　这些年来，为了减轻动物遭受的痛苦和使受损组织更快恢复，已经提出一些优化意见，例如低眼容量实验（LVET）。目前，减少和优化的方法已经包括在试验策略中，作为动物试验的补充，而体内兔眼试验仅需要在最后一步进行，也就是说当全部其他序列试验已经得出阴性评价结果，需要对轻度到中度的刺激性混合物进行评价时才考虑性体内试验。
　　
　　三、体外试验方法
　　1991至1997年间在欧盟机构主导下，共进行了6项眼刺激试验的评价研究，对9项体外替代方法进行了评估。当时的结论认为没有一项研究可以完全替代Draize实验，但其中的一些实验作为眼刺激物筛选的方法或组合试验的一部分可用于眼刺激试验的替代方法。后来经过持续改进，部分替代方法通过了ECVAM、ICCVAM等验证机构的验证，2009年，BCOP、ICE和IRE方法被OECD认可用于替代眼刺激试验。
　　1 牛角膜浑浊和渗透性实验（Bovine Corneal Opacity and Permeability，BCOP）使用屠宰场获得的标本，将新鲜分离的角膜水平固定于支持架，然后放置于特殊改进的透光容器里。恒温条件下，封闭角膜将测试容器分为上下2个隔室，受试物添加于上隔室中，通过测量下室培养液的光密度（OD）评估角膜的渗透性。测出的透光值和渗透值可用来进行体外分值计算。根据这一评分系统可对受试物进行分类。BCOP可用于化妆品原料及成品的安全评估，也可用于日用和工业用清洁产品、盥洗产品、杀虫剂等相关化学品和配方。BCOP实验非常适合用于测试不同物理性状和溶解度范围较大的受试物，适用于鉴定中度、重度和极重度眼刺激性物质，但对区分轻度到极轻度的水平的刺激物似乎不太敏感，后者更适合用上皮样组织结构或者细胞毒性方法进行检测。欧盟ECVAM和美国ICCVAM 于2007年通过对该方法的验证，2009年成为OECD正式试验指南（TG437）。
　　2 离体兔眼实验（isolated rabbit eye test，IRE），其原理是眼球接触刺激性物后，检测角膜透光值和角膜增厚（角膜肿胀）评价受试物的眼刺激性。从人道处死的实验兔分离完整眼球，固定和直立维持于超渗容器中，滴入生理盐水使角膜保持湿润。试验时，将受试样品直接与眼球接触。暴露时间不定，例如鉴定严重刺激物接触10秒，区分损伤程度较轻的受试物可接触1分钟或更长。去除受试物后，将眼球重新放入容器中，检查角膜透光值和角膜厚度。30分钟和1、2、3、4小时后进一步评估。染毒30分钟和4小时分别检查荧光素渗透性。记录角膜透光值和荧光素渗透性。根据获得的试验结果，通过不同观察指标的组合分析可对受试物的总体损伤做出评估。通常导致角膜水肿超过15%的化学物可认为具有严重眼刺激性。IRE实验适合检测大多数类型的受试物，特别是用来筛选严重刺激性的物质（R41）。IRE实验主要用来预测角膜损伤，它不能提供受试物对结膜的作用或角膜损伤后的恢复。因此不能绝对认为IRE实验中未观察损伤代表在体内也无作用。
　　3 离体鸡眼实验（Isolated Chicken Eye，ICE），ICE是一种利用离体鸡球短期培养进行眼刺激检测的体外方法，眼损伤通过角膜水肿、通透性和荧光素渗透进行评价。可用于评价腐蚀物和严重眼刺激物，或作为组合试验的一部分用于特定化学物质的法规分类的标识。其原理和具体操作过程类似于IRE。角膜水肿、透光值和荧光素滞留的数值作为毒理学终点。平均最大分值用于对无刺激到严重刺激物进行分类，计算ICE刺激指数，其范围从2到200。ICE实验可作为替代兔眼刺激试验的有效的常规检测方法。法国和德国均认可ICE实验用于鉴别严重刺激性物质。荷兰认可其作为鉴别“眼严重刺激物（R41）”的筛选方法，但不能作为区分刺激物和非刺激物的确认试验。CEET实验可用于化妆品和日用品企业实验室。欧盟ECVAM和美国ICCVAM 均于2007年通过对该方法的验证和认可。2008年列为OECD新的试验指南草案，2002年EU认可用于严重眼刺激物(R41)的鉴定和标识方法，2008年美国认可其作为组合试验策略中检测眼腐蚀物和严重眼刺激物的筛选方法。2009年OECD认可为试验指南438。
　　
　　
　　四、未验证的方法
　　1 鸡胚绒毛膜尿囊膜试验（Hen`s egg test on the chorio-allantoic membr