雌激素对缺氧／复氧心肌钙离子的影响

钟世刚，赵月柳，霍洪亮

（东北师范大学生命科学学院，吉林长春 130024）

雌激素对缺氧／复氧心肌钙离子的影响

钟世刚，赵月柳，霍洪亮

（东北师范大学生命科学学院，吉林长春 130024）

雌激素对心肌细胞缺氧／复氧损伤具有保护作用，但其保护机制尚未完全阐明.缺氧／复氧可引起心肌细胞损伤，其中发生钙超载是心肌损伤的一个重要因素.进行了雌激素对缺氧／复氧心肌细胞内钙离子浓度的影响研究.结果显示：心肌细胞缺氧／复氧后细胞内钙离子浓度明显升高，呈复氧时间依赖性增加.雌激素有抑制缺氧／复氧心肌细胞内钙离子浓度升高的作用，能有效防止心肌细胞钙超载.

雌激素；缺氧／复氧；钙超载

细胞内钙离子（Ca2＋）参与不同酶系和各种类型细胞生理活动的调节，这些功能只需要极微量的游离钙离子.心肌缺氧／复氧损伤可导致细胞内钙离子水平明显升高，产生钙超载现象.1972年Shen和Jennings发现细胞内钙超载在心肌缺血／灌注损伤发病机制中起主导作用［1］.在心肌缺血／灌注过程中有效抑制细胞内钙超载是保护心肌的重要途径之一.钙离子拮抗剂、钠钙交换蛋白（sodium－calcium exchange，NCX）抑制剂均能有效减轻钙超载的发生，减轻心肌缺血／灌注损伤，具有保护心肌细胞的作用［2－4］.有实验表明，给双侧卵巢切除大鼠大剂量补充外源性雌激素能直接阻滞心肌细胞Ca2＋通道，产生负性肌力作用，减少心肌耗能，防止心肌细胞缺血时Ca2＋超载引起的心肌细胞坏死，保护心肌细胞的收缩功能［5］.为进一步证明雌激素对钙超载的抑制作用，本实验利用原代培养的乳鼠心肌细胞，采用缺氧／复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤，观察了17－β雌二醇对缺氧／复氧心肌细胞内钙离子浓度的影响，为临床正确利用雌激素保护心血管功能提供了实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

取新生1～3 d的Sprague－Dawley（SD）大鼠（吉林大学基础医学部实验动物中心提供）心肌，原代细胞培养，72 h后更换无血清DMEM培养液.采用Koyama等方法配制缺氧液和复氧液，进行缺氧／复氧处理.雌激素（17－β雌二醇5μmol／L）于缺氧／复氧处理前24 h加入.

1.2 方法

1.2.1 MTT检测

以96孔细胞培养板原代培养心肌细胞，细胞密度为5×104个／孔，每组5个复孔；空白对照孔组只有培养液不含细胞.用10%胎牛血清培养基培养72 h后，更换无血清培养基；继续培养24 h，缺氧／复氧损伤后在培养基中加入5 g／L的MTT溶液20μL，继续培养4 h.弃上清液，每孔加入200μL二甲基亚砜，室温振荡10 min，酶标仪于490 nm处读取吸光值.

1.2.2 流式细胞仪检测

以0.25%胰酶消化收集各组心肌细胞，用D－HANKS洗涤样本2次后，重悬细胞于EP管中，室温避光条件下用Fluo－3／AM（0.01 g／L）负载细胞约30 min.流式细胞仪检测各组心肌细胞钙离子浓度.

1.2.3 免疫荧光检测

将Fluo－3／AM溶于二甲基亚砜中，按1 g／L配制，混匀后－20℃保存.用D－HANKS洗涤细胞玻片2次，在室温避光条件下用Fluo－3／AM（0.01 g／L）负载细胞约30 min，再用D－HANKS冲洗细胞2～3次，荧光显微镜下进行观察、拍照.

1.2.4 钙瞬变及钙浓度检测

用溶解有2.5μmol／L Fluo－3和20%Pluronic F－127的台式液37℃孵育心肌细胞30 min，再用台式液冲洗3次洗去多余染料.利用激光共聚焦显微镜以线扫描的方式检测胞内自发性钙瞬变.用波长488 nm的氩激光激发，在560～660 nm间接收发射光，采样速率为1.65 ms／线，沿细胞长轴纵向正中切面的中央进行扫描，然后进行图像处理和数据分析.

1.3 统计学分析

计量资料数据用平均值±标准差表示.应用SigmaStat3.5软件，对数据进行统计处理，应用onesamples T－Test分析或one－way ANOVA分析，P＜0.05为组间比较差异有显著性.

2 实验结果

图1 MTT检测各组心肌细胞活性变化

2.1 缺氧／复氧对心肌细胞活性的影响

如图1所示，由于活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶使MTT溶液还原为难溶的蓝紫色结晶，后者被二甲基亚砜溶解.根据490 nm处吸光值间接判断细胞存活率，缺氧／复氧损伤组细胞活性比对照组明显降低（P＜0.05）；雌激素组细胞活性明显高于缺氧／复氧组（P＜0.05）.

2.2 复氧时间对细胞内钙离子浓度的影响

如图2所示，正常对照组心肌细胞钙离子平均荧光强度为7.4±1.3，缺氧／复氧损伤后，钙离子荧光值有显著增加，并随复氧时间延长逐渐加强，复氧1，2，4 h时分别为13.85±4.9，30.18±1.8，51.25±1.4，均明显高于正常组，表明钙离子浓度随损伤组复氧时间延长显著升高.

图2 流式细胞仪检测不同复氧时间组心肌细胞内钙离子浓度变化

2.3 雌激素对细胞钙离子浓度影响

心肌细胞钙离子的累积光密度值正常对照组为4 376.348±18.55，缺氧／复氧（H 2 h／R 2 h）损伤组为16 280.3±27.64，明显高于正常组（P＜0.05）；实施雌激素孵育组心肌细胞钙离子的累积光密度值较损伤组明显减低（P＜0.05），见图3.

图3 免疫荧光检测各组心肌钙离子浓度变化

2.4 雌激素对钙瞬变的影响

心肌细胞自律性收缩时，细胞内钙离子浓度是一个动态变化过程，缺氧／复氧损伤能破坏细胞内外钙离子浓度的动态平衡.钙瞬变检测结果表明：缺氧／复氧组心肌细胞钙瞬变峰值和半高宽均有增加（见图4）.峰值反映在钙瞬变过程中细胞内流和钙库肌浆网释放钙的最大量，半高宽（钙信号强度超过峰值一半部分）反映钙瞬变过程中高浓度钙所持续的时间.缺氧／复氧损伤导致细胞钙通透增加，细胞内钙浓度（峰值）增加19.0%.缺氧／复氧损伤还导致细胞能量代谢障碍，影响细胞内钙离子外排和肌质网的摄入，钙离子在胞浆中滞留时间加长.钙瞬变时程（半高宽）增加78.5%.Ca2＋超载能加重心肌细胞损伤.

图4 心肌细胞钙瞬变激光共聚焦显微镜检测结果

3 讨论

雌激素的抗氧化作用曾在Kim等的研究结果中得到了证明［6－7］.心肌缺氧／复氧导致细胞膜损伤，使钙离子通透性增强，钙离子内流增加，导致高浓度钙离子在胞浆中滞留时间加长，钙瞬变幅值增大，增加线粒体对钙离子的摄取.因此，缺氧／复氧损伤破坏了细胞内能量代谢链，细胞膜钙泵外排钙离子能力和肌质网摄钙能力下降，影响心肌的正常生理活动.1992年Jiang报道了雌激素能够抑制豚鼠心肌的L型钙通道，后来人们相继运用不同的实验方法得到了相似的结果.2001年高瞻的实验结果也证明雌激素能降低收缩心肌细胞的钙瞬变，并且具有剂量依赖性.进一步的研究证明，雌激素通过抑制钙超载对心肌细胞有保护作用.本实验中，缺氧／复氧时间与细胞内钙离子浓度呈正相关.雌激素处理后细胞内钙离子浓度、钙瞬变幅值和半高宽均小于缺氧／复氧损伤组，因此，雌激素能够参与钙离子活动的有序调控.这可能是雌激素对心肌保护作用的机制之一.

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［4］MAGEE W P，DESHMUKH G，DENINNO M P，et al.Differing cardiop rotective efficacyof the Na＋／Ca2＋exchanger inhibitors SEA0400 and KB2R7943［J］.Am Physiol，2003，284：H903－H910.

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Effect of rstrogen on calcium concentration in myocardial cells suffering from Hypoxia／Reoxygenation

ZHONG Shi－gang，ZHAO Yue－liu，HUO Hong－liang

（School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China）

Estrogen can protect myocardial cells from Hypoxia／Reoxygenation injury，but the mechanism is not fully understood.Hypoxia／Reoxygenation can causes myocardial cells injury，in which the occurrence of calcium overload is an important factor.The aim of this study is mainly to investigate the effect of estrogen on calcium concentration in myocardial cells suffering from Hypoxia／Reoxygenation.Results shows that：after Hypoxia／Reoxygenation，the Calcium concentration in myocardial cells increased significantly，and in a Reoxygenation time－dependent manner.Estrogen can inhibit this increase induced by Hypoxia／Reoxygenation，and effectively prevent calcium overload in myocardial cells.

estrogen；Hypoxia／Reoxygenation；calcium overload

Q 463

180·2417

A

1000－1832（2011）04－0118－04

2011－06－23

吉林省科技发展计划项目（200905103）.

钟世刚（1982—），男，硕士研究生；通讯作者：霍洪亮（1963—）男，博士，副教授，主要从事心血管炎性机制研究.

方 林）