巨噬细胞移动抑制因子经Rho途径促进人肺成纤维细胞III 型胶原合成*

陈培芬， 罗雅玲， 赖文岩， 邢晓雯， 骆子义， 邱智辉

(深圳市第三人民医院1 内科，5胃镜室，广东 深圳518110;南方医科大学附属南方医院2 呼吸科，3心内科实验室，广东 广州510515;4广州医学院附属第一医院心内科，广东 广州510120)

气道重塑是哮喘具有特征性的病理改变之一。哮喘患者增厚的基底膜层主要是由I、III、V 型胶原纤维和成肌纤维细胞产生的纤维连接蛋白组成［1］。其中，Ⅲ型胶原的增生也是细胞外基质沉积的主要病理基础［2］。

巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是体内一种重要的多功能细胞因子，具有促炎、免疫调节等功能。新近的研究提示MIF 在气道重塑中起重要作用［3］，但其机制未明。本研究探讨了MIF 在人胚肺成纤维细胞合成Ⅲ型胶原中可能的作用及其途径，以初步探讨MIF 在气道重塑中的机制。

材 料 和 方 法

1 材料与试剂

DMEM 培养基购自Gibco;胎牛血清为PAA 产品;recombinant MIF(rMIF)购自R＆D;Trizol RNA 抽取试剂为Invitrogen 产品，逆转录试剂盒购自Fermentas;鼠抗人Ⅲ型胶原抗体购自Santa Cruz;HRP -兔抗鼠IgG(II 抗)购自北京博奥森生物技术有限公司;Rho 激酶抑制剂Y27632 购自BioSource;PCR 引物由上海英骏公司合成。

2 方法

2.1 细胞培养及分组 人胚肺成纤维细胞株MRC-5(购自中国科学院上海细胞生物学研究所)培养于DMEM 培养液中，培养液中加入10%胎牛血清，细胞在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。实验分为实验组和对照组，实验组分别加入不同浓度的rMIF(25-100 μg/L)。

2.2 RT-PCR 方法检测Ⅲ型胶原mRNA 的表达

使用6 孔板，对照组和实验组孵育完成后收集细胞，用Trizol 提取总RNA，紫外分光光度计检测纯度。反应分2 步进行:取5 μL 总RNA，在M-MLV 逆转录酶作用下合成cDNA;取1 μL 逆转录产物进行PCR 扩增反应。Ⅲ型胶原上游引物为5'-GCTGGCTACTTCTCGCTCTG-3'，下游引物为5'-AGCAGTTGGAGGCTGTGGG-3'，产物大小257 bp;GAPDH 上游引物为5' - ACCACAGTCCATGCCATCAC -3'，下游引物为5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，产物大小450 bp。PCR 反应条件如下:94℃预变性5 min，94℃1min，53℃45 s，72℃1 min，进行36 个循环，最后72℃10 min。实验重复3 次。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外透射反射仪观察扩增产物的大小及亮度并摄影。使用IPP6.0 图像分析软件对扩增条带进行分析，以平均灰度值代表相应基因的表达量，并除以GAPDH 灰度值，所得数值作为各扩增产物mRNA 的相对表达量。

2.3 Western blotting 检测III 型胶原蛋白表达 用预冷PBS 洗细胞3 次，加入200 μL 蛋白裂解液，刮起细胞，4 ℃12 000 × g，离心15 min，吸取上清，BCA 法测定总蛋白浓度。取40μg 的上述样品加样至15% SDS-PAGE 凝胶，电泳，待溴酚蓝接近凝胶底部时停止电泳，用转移缓冲液把凝胶上蛋白质转移至硝酸纤维膜上，室温下用5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，加入1∶ 500 稀释的鼠抗人III 型胶原抗体及β-actin 单克隆抗体，于4℃孵育12 h，然后加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(1∶10 000)室温孵育1 h，TBST 洗膜后用ECL 液显影，以β -actin 为内参照，用IPP 6.0 图像分析软件对III 型胶原蛋白进行半定量分析。

3 统计学处理

结 果

1 rMIF 对MRC－5 细胞III 型胶原mRNA 转录的影响

如图1 所示，rMIF 刺激人MRC -5 细胞后48 h，呈剂量依赖地促进III 型胶原mRNA 表达(P ＜0.01)。

Figure 1. rMIF induces collagen type III (Col III)mRNA synthesis in MRC-5 fibroblasts. A:an experiment of RT-PCR. Cells were stimulated with DMEM and rMIF at 25 -100 μg/L for 48 h. B:quantity of Col III mRNA expression presented by integrated value. ±s.n=6. ##P ＜0.01 vs control (0 μg/L).图1 不同浓度rMIF 刺激MRC－5 细胞III 型胶原mRNA表达

2 rMIF 对MRC－5 细胞III 型胶原蛋白表达的影响

如图2 所示，rMIF 刺激人MRC - 5 细胞后48 h，呈剂量依赖地诱导III 型胶原蛋白表达(P ＜0.01)。

Figure 2. rMIF induces collagen type III (Col III)protein expression in cells. A:an experiment of Western blotting. Cells were stimulated with DMEM and rMIF at 25 -100 μg/L for 48 h. B:quantity of Col III protein expression presented by integrated value. ± s. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs control(0 μg/L).图2 不同浓度rMIF 促进MRC－5 细胞III 型胶原蛋白合成

3 拮抗Rho 激酶抑制III 型胶原mRNA 表达

如图3 所示，加入Rho 拮抗剂后可显著抑制rMIF 诱导的III 型胶原mRNA 合成(P ＜0.01)。

4 拮抗Rho 激酶抑制III 型胶原蛋白表达

如图4 所示，加入Rho 拮抗剂后可显著抑制rMIF 诱导的III 型胶原蛋白表达(P ＜0.01)。

讨 论

细胞因子MIF 具有广泛的生物学功能如酶学功能、免疫调节功能。研究表明，MIF 可促进NIH3T3细胞增殖［4］，刺激血管平滑肌细胞合成I、III 型胶原mRNA 和I 型胶原蛋白，从而参与高血压血管重构［5］，与动脉内膜增厚有关［6］。提示MIF 在细胞增殖和胶原合成中具有重要作用。哮喘患者MIF 表达增加，是哮喘发病的关键因素［7-10］。而且MIF 可能诱导二异氰酸酯哮喘患者肺泡盥洗液中基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9，MMP - 9)表达［11］，MMP -9 在哮喘气道重塑中起重要作用。新近的研究也提示MIF 参与气道重塑［3］，但机制未明。

Figure 3. Effect of Y27632 on Col III mRNA expression in rMIF-stimulated MRC-5 cells. A:an experiment of RT-PCR. Cells were stimulated with DMEM，rMIF and Y27632 for 48 h. B:quantity of Col III mRNA expression presented by integrated value. ±s.n=6. ＊＊P ＜0.01 vs control.图3 Y27632 对rMIF 刺激的MRC－5 细胞III 型胶原mRNA 表达的影响

Figure 4. Effect of Y27632 on Col III protein expression in rMIF- stimulated MRC - 5 cells. A:an experiment of Western blotting. Cells were stimulated with DMEM，rMIF and Y27632 for 48 h. B:quantity of Col III protein expression presented by integrated value. ±s. n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control.图4 Y27632 对rMIF 刺激的MRC－5 细胞III 型胶原蛋白表达的影响

作为气道黏膜下的主要结构细胞之一，成纤维细胞(fibroblast，FB)的增殖和积聚可使气道壁增厚，管腔狭窄;并且FB 产生的胶原纤维、弹性纤维和网状纤维等沉积于基底膜，使气道壁进一步增厚。Ⅲ型胶原的增生成为细胞外基质沉积的主要病理基础［2］。有研究认为Ⅲ型胶原沉积是哮喘开始气道重塑的标志［12］。因此我们进一步探讨了MIF 与Ⅲ型胶原合成之间的关系。本研究结果表明，rMIF 可呈浓度依赖性促进Ⅲ型胶原mRNA 和蛋白表达。这提示MIF 可能通过促进成纤维细胞Ⅲ型胶原合成而参与哮喘的气道重塑。这与本研究的前期结果MIF 可促进MRC-5 增殖和I 型胶原合成是一致的［13］。

MIF 导致MRC-5 细胞胶原表达增多的机制尚不清楚。最近发现，MIF 可激活Rho 激酶途径［4］，而Rho 激酶在调控血管紧张素Ⅱ刺激大鼠心肌成纤维细胞增殖与胶原合成中具有重要作用［14］。大量研究提示Rho 激酶途径是哮喘气道重塑中的一条重要通路。Rho 抑制剂可抑制G 蛋白偶联受体(G protein -coupled receptor，GPCR)激动剂溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)诱导的人气道平滑肌细胞增殖，而且也抑制LPA 与表皮生长因子的协同作用［15］。有研究表明1 -磷酸鞘氨醇引起人肺成纤维细胞WI38 向成肌纤维细胞表型转化也是通过Rho激酶途径介导的［16］。

Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho -associated - coiled coil forming protein kinase，ROCK)是Rho 蛋白的下游靶效应分子之一。Y27632 是在细胞生物学和药理学研究中广为应用的ROCK 抑制剂。本研究在rMIF 刺激MRC -5 细胞前预先用Y27632处理，观察其对rMIF 促进胶原表达的影响。结果显示，rMIF 诱导MRC-5 细胞III 型胶原表达的能力可被Y27632 所抑制。由于Y27632 只特异性作用于Rho 激酶，因此本结果提示Rho 激酶信号通路参与了rMIF 诱导的MRC-5 细胞III 型胶原合成。

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