一株产耐高温淀粉酶菌株DW027的鉴定

陈 敏，王国强，余慧娟，朱苗青，章雅菁，汪 珏，向太和

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 310036）

一株产耐高温淀粉酶菌株DW027的鉴定

陈 敏，王国强，余慧娟，朱苗青，章雅菁，汪 珏，向太和

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 310036）

结合表型性状分析和16SrRNA序列及系统发育分析进行菌株的鉴定.结果显示，DW027菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，产芽孢.在LB平板培养基上，菌落呈白色、圆形.16SrRNA基因序列分析表明，与枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）标准序列的同源性达99%，初步鉴定为枯草芽孢杆菌.

淀粉酶；菌种鉴定；16SrRNA

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称，是最早实现工业化生产、迄今用途最广产量最大的酶制剂品种之一［1］，广泛应用于粮食加工、食品工业、纺织品工业和医药行业等.它所具有的重要商业价值，致使人们积极寻找产生该酶的新菌株，或者用生物工程的方法寻找该酶的基因，改造菌株［2］.

耐高温淀粉酶是淀粉加工中有重要用途的一种酶，因为以淀粉为原料的工业生产过程一般在高温下进行.在液化淀粉方面，耐高温淀粉酶与一般细菌淀粉酶相比具有节约能源、降低成本等优点，且耐高温淀粉酶稳定性好、保存条件范围宽、易于储存和运输［3］.目前，国内有关耐高温淀粉酶的菌种筛选、淀粉酶的性质等方面已有不少报道.张强等［4－5］从土壤中分离到一株能在55℃生长并分泌耐高温α－淀粉酶的菌株，经初步鉴定为芽孢杆菌.宋素琴等［6］从乌鲁木齐地区的啤酒厂等地采集样品，筛选到一株酶活较高的α－淀粉酶产生菌，经生理生化反应鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），并对其酶学性质进行了初步研究.王春铭等［7］从堆肥中筛选到一株能在55℃生长并分泌高温α－淀粉酶的菌株，经初步鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis），该菌株对污泥有机质具较强降解能力.但总体来看，目前国内淀粉酶生产菌株仍比较单一，淀粉酶酶活也较国外同行业低.该实验室通过平板筛选的方法，从杭州七堡污水处理厂污泥样品中分离到一株产耐高温淀粉酶的菌株DW027（另文报道），通过表型性状和16SrRNA序列及系统发育分析等方法进行了菌株鉴定，为工业应用开发新的淀粉酶资源打下基础.

1 材料和方法

1.1 菌 株

DW027菌株：杭州师范大学生命与环境科学学院微生物实验室分离保存.

BacillussubtilusAB92068（标准菌株）：购自中国典型培养物保藏中心.

1.2 培养基

LB液体培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 2%，pH 7.0.

LB固体培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，琼脂0.6%，pH 7.0.

1.3 主要试剂和仪器

UNIQ－10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（SK－1201）、蛋白酶K、溶菌酶、Taq DNA聚合酶等购自上海生工，其他化学药品均为国产分析纯试剂.

主要仪器有光学显微镜（Nikon YS2）、扫描电子显微镜（JEOL model JSM5600LV）、全自动高压灭菌锅（NVE－50）、电子天平（BP2100S型）、高速冷冻离心机（Centrifuge 5810R）、电泳仪（DYY5型）、PCR仪（DTC－100）等.

1.4 菌株鉴定

1.4.1 形态鉴定

将菌种在LB斜面培养基上培养14～16h，分别进行单染色、革兰氏染色和芽孢染色等形态观察，方法参见《常见细菌鉴定手册》［8］.

将菌种在LB平板培养基上划线培养24h，对菌落形态进行描述.

1.4.2 生理生化鉴定

用标准菌株做对照，依据文献相关内容［8－9］进行.

1.4.3 16SrRNA序列及系统发育分析

基因DNA的提取、16SrRNA的扩增及序列分析参见文献［10］.引物采用细菌16SrRNA PCR扩增通用引物BSF8P20（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和BSR1541P20（5′－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3′）.PCR扩增条件：94℃下预变性10min，按照94℃45s、55℃45s、72℃90s进行30个循环，最后在72℃延伸10min.将16SrRNA PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工进行序列测定.通过GenBank数据做相似性分析，然后通过MEGA构建系统进化树.

2 结果与分析

2.1 DW027菌株的形态鉴定

通过光学显微镜和扫描电子显微镜观察，DW027菌体细胞呈杆状，大小为2.8μm×0.75μm，革兰氏染色阳性，产芽孢，中生，芽孢椭圆形，芽孢囊不明显膨大（图1）.

LB琼脂平板上培养48h的菌落形态为圆形，扁平，边缘不整齐，白色，不透明，菌落质地湿润，表面有褶皱（图2）.

2.2 16SrRNA序列及系统发育分析

16SrRNA序列常用于细菌系统发育分析.利用细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增，序列测定结果表明，16SrRNA扩增片段长度为1 514bp，GenBank登录号EU650320.

利用Blast软件与数据库中已有细菌16SrRNA序列进行相似性比对分析，结果表明：菌株DW027与芽孢杆菌属（Bacillus）相似性最高，与多个枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilus）菌株序列相似性高达99%.利用MEGA构建系统进化树，如图3所示.

图3 依据16SrRNA基因序列比较构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain DW027based on analysis of 16SrRNA sequences

2.3 生理生化鉴定

DW027菌株的生理生化试验结果如表1所示.除需氧性以外，其主要特征与标准菌株Bacillus subtilusAB92068相吻合.综合以上结果，初步鉴定DW027菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilus）.

表1 菌株DW027的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain DW027

3 结 论

该研究利用细菌16SrRNA一对通用引物，对DW027进行16SrRNA序列同源性分析.扩增结果与GeneBank上的标准序列进行比对后显示，DW027菌株与枯草芽孢杆菌标准序列的同源性都在99%以上.生理生化鉴定结果进一步表明其主要特征与枯草芽胞杆菌标准菌株吻合.因此，初步鉴定DW027菌株为枯草芽孢杆菌.

致谢：胡健饶老师在电镜技术方面给予了悉心的指导，谨致谢意！

［1］胡欣洁，李凛，王忠彦，等.耐酸性α－淀粉酶产生菌的选育［J］.酿酒科技，2005（5）：39－41.

［2］Pandey A，Nigam P，Soccol C R，etal.Advances in microbial amylases［J］.Biotechnol Appl Biochem，2002，31：135－152.

［3］林必博.耐高温α－淀粉酶的研究进展［J］.河北农业科学，2011，15（2）：77－80.

［4］张强，黄丹，王川.耐高温α－淀粉酶产生菌的选育研究［J］.中国酿造，2008（7）：21－23.

［5］张强，刘成君，蒋芳，等.耐高温α－淀粉酶产生菌的分离鉴定及发酵条件和酶性质研究［J］.食品与发酵工业，2005，31（2）：34－37.

［6］宋素琴，茆军，顾美英，等.一株碱性高温α－淀粉酶产生菌的分离鉴定及其酶学性质初步研究［J］.新疆农业科学，2010，47（9）：1803－1807.

［7］王春铭，雷恒毅，王国惠，等.高温α－淀粉酶菌的产酶条件、酶性质与环境应用研究［J］.环境科学学报，2007，27（4）：600－607.

［8］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001：253－298.

［9］Hot G T，Krieg R N，Sneath H A P，etal.Bergey's manual of systematic bacteriology［M］.9th ed.Baltimore：Willians and Wilkins，2001：294－334.

［10］奥斯伯F，布伦特R.精编分子生物学实验指南［M］.颜子颖，王海林，译.北京：科学出版社，1998：1330－1361.

Identification of a Thermo－α－Amylase Producing Strain DW027

CHEN Min，WANG Guo－qiang，YU Hui－juan，ZHU Miao－qing，ZHANG Ya－jing，WANG Jue，XIANG Tai－he
（College of Life and Environmental Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）

A thermo－α－amylase producing strain DW027was identified based on phenotypic characters and phylogenetic analysis as well as 16SrRNA gene sequencing.The results show that the strain is Gram－positive，endospore－forming，rods in shape.Colonies of strain DW027were white，convex and round on LB plates.The 16SrRNA gene sequencing analysis show that the strain is closely related to the member ofBacillussubtilis，with which they share 99%similarity.

amylase；identification；16SrRNA

Q93

A

1674－232X（2011）06－0481－04

10.3969/j.issn.1674－232X.2011.06.001

2011－06－28

浙江省自然科学基金项目（Y307452）；杭州市科技发展计划项目（20101032B26）.

陈 敏（1963—），女，浙江杭州人，教授，主要从事微生物研究.E－mail：mchen63＠163.com