污泥生物沥滤中硫细菌变化和胞外多聚物作用的研究

华玉妹,陈英旭,张少辉 (.浙江大学环境工程系,浙江 杭州 0029；2.华中农业大学资源与环境学院,湖北武汉 40070；.武汉理工大学土木与建筑学院,湖北 武汉 40070)

污泥生物沥滤中硫细菌变化和胞外多聚物作用的研究

华玉妹1,2*,陈英旭1,张少辉3(1.浙江大学环境工程系,浙江 杭州 310029；2.华中农业大学资源与环境学院,湖北武汉 430070；3.武汉理工大学土木与建筑学院,湖北 武汉 430070)

通过序批试验,分析污泥生物沥滤过程中 pH值、异养菌数量变化以及硫细菌的形态,探讨了污泥中重金属在胞外多聚物(EPS)中的分布变化.结果表明,污泥经生物沥滤后异养菌大量死亡.扫描电镜和透射电镜对污泥微生物形态的观测发现,随着生物沥滤时间的延长,生物沥滤污泥明显比对照污泥中的微生物分布紧密,而且杆状和短杆状菌呈现逐渐增多趋势.生物沥滤后期出现受损的细菌胞体以及释放了细胞物质的细菌空壳.污泥沥滤液中EPS含量有所增加,沥滤过程中EPS的松散结合态与紧密结合态的比值呈现先上升后下降趋势,可反映沥滤前期细菌处于加速生长期的居多,而后期处于减速生长期的细菌逐渐增多.污泥 EPS中重金属含量在生物沥滤几天后表现持续增长,Cu、Pb和Zn分布于EPS中的最高含量分别占污泥中总量的14.7%、20.3%和24.2%.延长酸化时间,EPS可被水解,而导致其中重金属含量呈现一定下降趋势.

污泥；生物沥滤；硫细菌；胞外多聚物；重金属

污水处理过程产生的大量重金属富集在污泥中[1],限制了污泥资源化利用.污泥生物沥滤是一种运用产酸细菌作用将污泥重金属溶出去除的无害化技术[2].目前对于污泥生物沥滤的研究集中在底物类型(FeSO4,FeS2和单质硫)等影响因素[3-5]、生物沥滤的污泥除臭、脱水和消化效果

[6-7]以及污泥肥效变化等方面[7-8],多侧重于工艺应用的研究.污泥生物沥滤过程类似于好氧消化,原有微生物会出现一定程度死亡.但不同于好氧消化的是,生物沥滤还伴随着硫细菌的增殖过程,探讨生物沥滤过程中优势硫细菌的变化,对于更好地指导其应用具有重要意义.

微生物产生的胞外多聚物(EPS)在污泥对重金属的富集过程中起着重要作用,大部分金属离子通过物理化学作用被吸附在EPS的结合点位上,与污泥一同沉降[9-11].重金属离子与EPS的络合较为稳定.明确EPS在污泥生物沥滤过程中的作用状况,有助于更好地理解生物沥滤对重金属的内在作用过程.

本研究分析了污泥生物沥滤中pH值、异养菌数量变化以及硫细菌的形态,探讨了污泥生物沥滤过程中重金属在EPS中的分布变化.

1 材料与方法

1.1 污泥样品

污泥取自杭州市四堡污水处理厂,该厂同时接纳杭州市部分城区的生活污水和工业废水.该厂初沉池和二沉池的污泥均进入污泥浓缩池,之后再进入厌氧消化池.采样时从厌氧消化池前的污泥入口处采集,即为初沉池和二沉池的混和生污泥.污泥初始性质:pH 6.8, Cu、Zn和Pb含量(以干污泥计)分别为296.4,351.3,3756.2mg/kg.

1.2 生物沥滤序批试验

试验采用混合硫细菌接种液的接种量为2%,单质硫粉的投加浓度为3g/L,混合硫细菌接种液的培养方法[12].取200mL污泥于500mL锥形瓶中,在(28±1)℃振荡摇床上运行,转速为 120r/min.每一样品做3个平行样.每天通过称重,以蒸馏水补充蒸发损失的水分.取样后,将污泥样品在10000r/min下离心 10min,经中速定量滤纸过滤后,进行各项目分析测定.

1.3 细菌培养基

嗜酸和弱嗜酸硫细菌的培养采用琼脂培养基[13-14].A液为基础盐, B液为能源物,C液为培养基的固化剂.

A液:(NH4)2SO42g, KCl 0.1g, K2HPO40.25g, MgSO4·7H2O 0.25g,Ca(NO3)2·4H2O 0.01g,溶于500mL蒸馏水中;B液:将22.1g Na2S2O3·5H2O溶于300mL蒸馏水中; C液:将30g琼脂粉溶于加200mL蒸馏水中.

A、B和C液分开湿热灭菌,冷却至80℃后,三者混合后,按体积均分,各500mL.将两者用1:5的H2SO4或20%的NaOH分别调pH值为4.0和7.0,迅速倒平板.pH4.0的培养基用于培养嗜酸硫细菌, pH7.0的培养基用于培养弱嗜酸硫细菌.取1mL生物沥滤污泥于10mL具塞试管中与9mL灭菌的磷酸盐缓冲液(0.01mol/L, pH7.2)迅速混合均匀,试管中放入5颗直径3～5mm的玻璃珠,然后,按此法依次稀释到10-8倍,取10-4～10-8倍数的污泥样品各0.1mL进行涂布,培养均采用3个平行,28℃培养2周.

异养菌培养采用肉膏蛋白胨培养基[15].

1.4 污泥EPS的分离提取

采用物理方法分离EPS[16-17],步骤如下:采用3个平行样,各取25mL污泥混合液置于30mL的离心试管内,在6000r/min离心5min,倾出上清液.将污泥颗粒悬浮于 15mL生理盐水中,并放入玻璃珠若干,在超声仪中超声2min,于摇床150r/min下水平振摇 10min,再超声 2min,而后在8000r/min离心 10min,上清液即为松散结合态(LB),取之测其质量.LB分离后的污泥颗粒采用热提取法提取紧密结合态(TB),颗粒重新悬浮于25mL生理盐水中,超声 3min,80℃水浴加热30min,12000r/min离心20min,上清液即为TB,取之测其质量.EPS质量为LB与TB质量之和.

提取的LB和TB,经105℃烘干,在550℃马弗炉焙烧4h,然后用30%HNO3加热溶解,测其重金属含量[18].

1.5 分析测试

污泥pH值采用pHS-3C型酸度计测定.

Cu、Pb和Zn浓度采用Perkin Elmer AA100型原子吸收分光光度计测定.污泥重金属总量采用HF-HClO4法消解后,用HCl和热水溶解,原子吸收分光光度法测定.

采用 Philip XL30 ESEM 型扫描电镜、JEM-1200EX型透射电镜观察污泥样品的微生物形态.将琼脂培养基上培养好的典型菌落用接种环挑出于去离子水中,轻轻晃动使菌落散开,然后将圆形铜片浸入吸附部分细菌,稍晾干,即可进行透射电镜观察嗜酸和弱嗜酸硫细菌.

2 结果与讨论

2.1 污泥生物沥滤过程中pH值变化

pH值的变化见图1.pH值在第2d先有所上升,随后出现快速下降,第5d后降至2以下,最后稳定在1.5左右.当pH值降到1.5以后,则对硫细菌产生抑制作用,酸化过程终止.空白样在第 2d也出现 pH值上升的现象,但一直持续到第 10d方出现下降,且下降幅度不大,由 7.4降至 5.8,这主要是由于好氧消化导致污泥发生水解酸化而造成的. pH值是影响硫细菌生长进而影响重金属沥滤效率的重要因素.污泥中存在弱嗜酸硫细菌和嗜酸硫细菌,二者的比生长速率和之间的数量比例取决于污泥pH值,反过来又对污泥pH值起作用.在投加适量硫的污泥中,弱嗜酸硫细菌在中性 pH值下即可迅速生长,促使 pH值降低. pH4.0左右时弱嗜酸硫细菌停止生长,嗜酸硫细菌开始大量增殖,使污泥pH值进一步降到2.0以下,两类细菌之间存在一种互生关系,通过协同作用共同降低pH值[19-20].

图1 污泥生物沥滤过程中pH值的变化Fig.1 Variation of pH during bioleaching

2.2 异养微生物数量变化

污泥重金属的生物沥滤过程中,适宜底物使硫细菌增殖,而污泥中原有的大多数异养微生物,由于其不能耐受硫细菌产酸所形成的极端环境而逐渐死亡.

由图2可知,对照为未加接种液和单质硫的污泥,第3d,对照和生物沥滤污泥的pH值分别为5.7和3.5,两者的异养菌数量都出现下降,但差别不大,到第7d,对照污泥pH值为5.6,生物沥污泥pH 值为 1.9,两者的异养菌数量分别为7.7×108,2.7×107个/mL.可见生物沥滤的酸性环境能够导致异养微生物的大量死亡.

图2 生物沥滤过程中污泥异养细菌数量变化Fig.2 Variation in heterotrophic microorganism amount during bioleaching

2.3 扫描电镜和透射电镜微生物形态观测

污泥重金属的生物沥滤过程中,适宜底物使硫细菌增殖,而污泥中原有的大多数异养微生物,由于不能耐受硫细菌产酸所形成的极端环境而逐渐死亡.借助于扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)研究生物沥滤不同阶段的污泥样品,可以了解污泥生物沥滤过程中微生物种群的形态变化.

以单质硫为底物的硫细菌,如氧化硫硫杆菌和排硫硫杆菌,绝大多数为杆状或短杆状.从图 3可以看出,第 3d,生物沥滤污泥与对照并没有显著差异.而到第 7d,生物沥滤污泥中菌量有所增加,可以观察到明显成簇聚集的杆状和短杆状细菌.这些细菌长约1～2μm,直径约0.5μm.到第11d生物沥滤污泥中明显看出杆状菌数量增多,分布密集,推测其为大量硫细菌通过EPS吸附在单质硫上以获取底物营养,细菌成簇生长有利于协同作用以抵抗不良环境的影响.结合污泥 pH值的变化(图1),可以得知,第3d生物沥滤污泥pH值降至4左右,说明此时弱嗜酸硫细菌已经开始明显增殖.污泥pH值在第7d时为2左右,并进一步下降,说明此时并未达到硫细菌增长最高峰,硫细菌从数量上仍然将继续增加.从总体来看,随着生物沥滤的进行,优势菌有由椭圆和圆形逐步向短杆状和杆状过渡的趋势.而对照污泥中不但杆状菌较少,细菌总数也相对较少,大多分布较为分散,没有出现杆状菌增多的趋势.

图3 污泥扫描电镜照片Fig.3 SEM graph of sewage sludge

由图4的TEM照片可以看出,第11d的生物沥滤污泥中含有多种杆状菌或短杆状菌,不同的杆状菌形态存在很大差异,细胞壁的光滑度也存在很大差异.有的细菌具有纤毛,体内存在若干颗粒,可能是积累的碳粒或硫粒(图 4b),但目前尚未分离纯化到积累硫粒的硫细菌[21].同时发现许多细菌的空壳以及受损的胞体(图4a,图 4b),这可能是污泥中原有异养微生物在酸性条件下发生细胞水解形成的,也可能是进入衰亡期的硫细菌.可以结合下一步弱嗜酸菌和嗜酸菌的TEM进行分析.

将生物沥滤污泥进行透射电镜观察,图5为生物沥滤第3d时的弱嗜酸硫细菌,图5a为处于分裂期的细胞,图5b与图4a中若干细菌形态很相似,这说明生物沥滤后期弱嗜酸硫细菌出现大量死亡和细胞水解.图5c为约十几个杆状菌连生的情况,弱嗜酸硫细菌结合成长链状生长,并通过所产生的 EPS相互融合,而将其菌体完全包埋,这有利于抵御其它生物的侵袭以及抵抗不良外界条件.Wilkinson[22]曾以进化论的观点指出, EPS的存在表明它可能具有保护功能,使细胞免受外界环境有害因素的影响,同时细胞也可借助EPS的吸附能力从较低浓度生长介质中吸收所 需离子.

图4 第11d的生物沥滤污泥透射电镜照片Fig.4 TEM graph of bioleaching sludge on 11th day

图5 弱嗜酸硫细菌透射电镜照片Fig.5 TEM graph of less acidophilic sulfur-oxidizing bacteria

图6 嗜酸硫细菌透射电镜照片Fig.6 TEM graph of acidophilic sulfur-oxidizing bacteria

图6为生物沥滤第11d时的嗜酸硫细菌透射电镜图,可看出,嗜酸硫细菌形状和大小与图 4c若干颜色较深的细菌形态较为相似(后者因样品的切片处理而观测到部分细菌的横切面),图 6a为多个短秆状菌通过EPS结合在一起.试验中所观测的嗜酸硫细菌不生鞭毛,而且也未发现脱落的鞭毛.说明所生长的嗜酸硫细菌为不生鞭毛的细菌,可能为不运动型.

2.4 EPS的变化

EPS是指细菌在一定的环境条件下分泌于细胞体外的高分子有机物,主要组分是多糖、蛋白质,另外有少量的腐殖质、糖醛酸和核酸[23].由于在菌体外所处的特殊位置及其特定的化学组成,使其成为影响细菌表面特性的重要因素.从表1可以看出,EPS质量占污泥干重的25.0%～43.3%,与其他研究者的结果较为一致[24].EPS的一个主要来源是细菌生长过程中的代谢产物以及细胞自溶物,在加速生长期细菌主要排泄低分子聚合物,与细胞体结合不紧密,多属 LB;而减速生长期和内源呼吸期主要排泄高分子聚合物,与细胞体结合较紧密,多为TB[25].LB/TB在前8d是处于上升趋势,而后则出现下降,这说明在最初几天处于加速生长期的细菌较多,总体来说是处于加速生长期,而后期处于减速生长期的细菌逐渐增多.

表1 EPS占污泥干重百分比的变化Table 1 Percentage of EPS with respect to dry sewage sludge during bioleaching

2.5 EPS中重金属分布

EPS中吸附金属离子的主要是糖类.Brown等[9]指出,EPS内的中性糖和阴离子多糖有着吸附不同金属离子的结合点位,不同价态或不同电荷的金属离子可以在不同点位与EPS结合,如中性糖的羟基、阴离子多聚物的羧基都可能是金属的结合位.污泥EPS可分为紧密结合态(TB)和松散结合态(LB),TB在内层,与细胞表面结合较紧,相对稳定地附着于细胞壁外,通常为胞囊多聚物;LB在外层,为无明显边缘的粘液层,以胶体或溶解状态存在于液相主体中,具有流变特性,可向周围环境扩散,一般指粘质多聚物[16].

图7为EPS中Cu、Pb和Zn含量在生物沥滤过程中的变化.沥滤第2d,重金属在LB与TB中含量很接近,两者都较低,从整个运行周期总体来看,Cu在LB中含量高于TB,说明EPS中更多的Cu松散存在于EPS的外层,而Pb和Zn在LB和TB两部分中分布比例较为接近.

图7 EPS中Cu, Pb和Zn含量在生物沥滤过程中的变化Fig.7 Content of Cu, Pb and Zn in EPS during bioleaching

沥滤初期EPS中Cu含量出现下降,这主要是因为最初几天的弱酸性环境中,结合在污泥微生物EPS中的部分Cu有一定程度溶出.Cu在污泥细胞内含量比较多,这部分金属不会很快经由EPS而溶出,所以起始阶段EPS中Cu含量必然会下降.Pb在EPS中含量的变化与Cu相似,而Zn却呈现出与前两者不同的变化趋势,其含量基本呈上升状态,这是由于污泥细胞所吸收的 Zn含量较低,因此大部分 Zn吸附或结合在胞外,这部分Zn的溶解对于pH值的要求低于胞内Zn,所以最初4d结合在污泥微生物外的Zn即能够快速溶出,溶出过程中经由EPS,Zn在EPS中含量即出现大幅度升高.Cu、Pb和Zn在整个周期分布于EPS中的最高含量分别占其污泥中总量的14.7%、20.3%和24.2%.

污泥EPS中重金属含量在生物沥滤几天后表现持续增长,原因在于:大量增殖的硫细菌也能分泌EPS,以便附着于底物单质硫上,因而溶液中的部分重金属可能又被吸附或结合到硫细菌的EPS中.随着酸化环境的加剧,细胞水解而释放出胞内物质,积累在污泥细胞内的重金属也发生释放,由于微生物被EPS所包埋,释放的重金属经由EPS到达污泥液相中,EPS主要成分为多糖等高分子有机物,故一部分重金属必然与其发生络合等作用而滞留在 EPS中.然而随着沥滤的进行,因EPS并非生物惰性物质[26],酸化条件下仍可以被生物降解,故延长酸化时间的情况下,EPS可能被水解,从而释放出结合在其中的重金属.试验结果也证明这一点,沥滤第12d,EPS中Cu和Zn含量均呈现一定的下降趋势.

3 结论

3.1 生物沥滤过程中,硫细菌生长引起pH值降低,污泥中异养菌逐渐死亡,异养细菌数降低2个数量级.SEM和TEM对生物沥滤过程中污泥微生物形态的观测发现,随着生物沥滤时间的延长,生物沥滤污泥明显比对照污泥中的微生物分布紧密,而且杆状和短杆状菌呈现逐渐增多趋势.生物沥滤末期出现释放出细胞物质的细菌空壳,以及受损的细菌胞体.

3.2 污泥沥滤过程中EPS含量有所增加,EPS中LB/TB值呈现先上升后下降,可反映前期细菌沥滤加速生长期的居多,而后期处于减速生长期的细菌逐渐增多.污泥EPS中重金属含量在沥滤几天后表现持续增长,Cu、Pb和Zn在整个周期分布于EPS中的最高含量分别占其在污泥中总量的14.7%、20.3%和24.2%,不同金属在EPS中的含量变化存在差异.延长酸化时间,EPS可被水解,而导致其中重金属含量呈现一定下降趋势.

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Variation in sulfur bacteria and extracellular polymeric substances during sewage sludge bioleaching.

HUA Yu-mei1,2*, CHEN Ying-xu1, ZHANG Shao-hui3(1.Department of Environmental Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China；2.College of Resources and Environment, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；3.School of Civil Engineering and Architecture, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China) China Environmental Science, 2011,31(5)：795～802

Lots of heterotrophic bacteria died after sewage sludge bioleaching. The exploration of microbial communities using scanning electron microscopy and transmission electron microscopy illustrated that the bacteria distribution in bioleaching sludge was more intensive than that in the control sludge, and the rod-shaped and short rod-shaped bacteria appeared to increase with the extension of time. The damaged bacteria cell and residual cell without intracellular matter emerged at the anaphase of bioleaching. The weight percentage of extracellular polymeric substances (EPS) in the sludge leachate increased after bioleaching. The EPS ratio of loosely bound fraction to tightly bound fraction exhibited an upward trend followed with a downward trend, which indicated that large quantities of bacteria were at accelerated growth phase during the prophase of bioleaching while at deceleration growth phase during the anaphase of bioleaching. The content of heavy metals in the EPS showed a continuous increase after several days of run. The highest content percentages of Cu, Pb and Zn in the EPS with respect to the total sludge content were 14.7%、20.3% and 24.2% respectively. EPS could be hydrolyzed under prolonged bioleaching, resulting in a decrease of heavy metals content in EPS.

sewage sludge；bioleaching；sulfur bacteria；extracellular polymeric substances；heavy metals

X703.1

A

1000-6923(2011)05-0795-08

2010-09-10

国家自然科学基金资助项目(50809030);长江水环境教育部重点实验室开放基金(YRWEF08002)

* 责任作者, 副教授, ymhua@mail.hzau.edu.cn

华玉妹(1974-),女,山东莱阳人,副教授,博士,主要从事废物处理处置与资源化、水环境研究.发表论文20余篇.