甲磺酸伊马替尼的耐药机制及逆转策略

吴荣娟(综述)，马旭东(审校)

(福建医科大学附属漳州市医院血液科，福建漳州363000)

慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一种发生在早期多能造血干细胞上的恶性骨髓增殖性疾病。95%以上的CML细胞中有特征性t(9;22)(q34;q11)，形成bcr/abl融合基因，其编码的p210bcr/abl蛋白具有高酪氨酸激酶的活性，可导致自身酪氨酸残基磷酸化及许多重要的底物蛋白磷酸化，使细胞恶性转化，过度增殖和凋亡受阻。甲磺酸伊马替尼是2-苯氨嘧啶的衍生物，是作用于bcr/abl酪氨酸激酶的抑制剂，它能竞争性抑制ATP或底物与酪氨酸激酶催化中心结合，阻止酪氨酸激酶活化从而发挥靶向治疗作用。

1 伊马替尼的耐药机制

随着伊马替尼治疗时间的延长，原发或继发耐药导致的治疗失败越来越多见，已严重制约了其临床应用。目前对于伊马替尼的耐药机制的主要观点如下。

1．1 bcr/abl融合基因的点突变 目前认为，bcr/abl基因突变是甲磺酸伊马替尼产生耐药的常见机制。已检测到的突变有100多种，可发生在ABL激酶的ATP结合环(P-环)、激活环(A-环)或在两者之间的非催化区。点突变引起ABL激酶氨基酸改变，通过直接阻断伊马替尼与ABL激酶的结合或者妨碍ABL激酶失活构象的形成而干扰药物与靶位点的结合，最终导致耐药的发生。Kim［1］及 O'Hare等［2］对 70例伊马替尼耐药的CML患者进行研究，发现81个突变点，9例为多位点突变。其中，T315I位点(苏氨酸变为异亮氨酸)突变率最高，其次为E255K、Y253H、G250E点突变，而且 Y253H、E225K、T315I和 F317L突变随着CML疾病的进展出现频率增加。

1．2 bcr/abl基因扩增及其表达增加 靶基因扩增和表达增加是许多抗肿瘤药物耐药原因之一。Weisberg等［3］采用伊马替尼药物浓度递增法诱导小鼠前B淋巴细胞(Ba/F3-p210)(p210bcr/abl质粒转染细胞)及K562细胞产生伊马替尼耐药，结果显示Ba/F3-p210细胞耐药机制为bcr/abl基因扩增，mRNA及p210蛋白高表达。而相同方法诱导的K562耐药细胞未发现bcr/abl基因扩增，而仅仅有2～3倍的p210蛋白表达增加。

1．3 P糖蛋白的作用 P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由多药耐药(multidrug resistance，MDR)基因MDR1编码的一种跨膜糖蛋白，由1 280个氨基酸构成，属于典型的ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白超家族成员，能利用ATP水解释放的能量主动将疏水亲脂性化疗药物转运至细胞外，导致细胞内药物浓度低于杀伤浓度，从而使肿瘤细胞产生 MDR。Thomas等［4］采用14C标记伊马替尼在P-gp阳性表达细胞系上证实伊马替尼确实通过P-gp通道转运出细胞外。

1．4 白血病干细胞的影响 Holtz等［5］研究指出，CML的白血病干/祖细胞对伊马替尼不敏感，伊马替尼并不能有效抑制其增殖并诱导其凋亡。房佰俊等［6］和 Fang 等［7］在对 bcr/abl+Flk1+CD31-CD34-细胞的研究中进一步证明，伊马替尼对分化成熟或相对成熟的白血病细胞具有明显的生长抑制作用，但对CML的原始白血病干细胞则可能是部分、甚至是完全耐药的。

1．5 蛋白酶体的参与 齐静［8］在对K562及伊马替尼耐药株K562/G0l细胞进行差异蛋白组学分析时，揭示出包括蛋白酶体在内的10个蛋白与白血病伊马替尼耐药相关，在后续实验中证实了蛋白酶体确实参与了白血病细胞对伊马替尼耐药的发生，并阐明蛋白酶体通过增加IκB抑制因子的降解，促进药物作用下核因子κB的核转位和活化以及加速伊马替尼作用靶蛋白bcr/abl的更新，使白血病细胞对伊马替尼产生耐药。

1．6 其他蛋白酪氨酸激酶的作用 近来发现Src家族中的Lyn激酶能调节伊马替尼治疗CML的敏感性，并且在伊马替尼治疗失败并未出现bcr/abl突变情况的患者体内发现持续的Lyn激酶活性。研究显示，Lyn不仅影响CML疾病的进程，而且在bcr/abl没有突变的CML中能够保持组成性活化而影响细胞对伊马替尼的敏感性［9］。

1．7 其他耐药机制 ①JAK激酶/信号转导和转录激活因子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)通路的作用。JAK/STAT是bcr/abl的众多下游信号途径之一。有研究发现［10］，JAK2抑制剂 AG490对伊马替尼耐药细胞32Dp210-T315I的抑制作用比伊马替尼敏感细胞32Dp210更显著，可能在耐药细胞中JAK/STAT通路占主要地位。②蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)的异常表达。有研究表明，在许多恶性肿瘤如子宫内膜癌、肝癌、前列腺癌、结直肠癌、滤泡状甲状腺癌、肺癌和白血病中，磷酸化AKT呈持续高度活化，而且AKT的异常表达与这些肿瘤细胞的增殖、凋亡以及对放化疗产生的耐受性密切相关。

2 逆转耐药的策略

2．1 增加用药量 研究显示［11］，先前采用400 mg/d伊马替尼治疗产生血液学和细胞遗传学耐药的患者接受800 mg/d伊马替尼治疗后，65%达完全血液学缓解，18%达完全细胞遗传学缓解。先前未使用过伊马替尼的慢性期患者使用800 mg/d伊马替尼后有66%达完全细胞遗传学缓解。Kantarjian等［12］研究表明，增加伊马替尼剂量可以克服一些患者的血液学或细胞遗传学的耐药，但仅对低水平的伊马替尼耐药有效(如H386P型突变)，对高水平突变(如T315I或E255K)则无效。

2．2 第二代及第三代酪氨酸酶抑制剂 尼罗替尼及达沙替尼均为第二代酪氨酸激酶抑制剂。Ⅰ、Ⅱ期多中心临床试验证明［13］，尼罗替尼和达沙替尼对于各期伊马替尼耐药和伊马替尼不耐受的CML患者都显示出显著的临床疗效，其安全性和耐受程度也是可以接受的。尼罗替尼是选择性ABL激酶抑制剂属伊马替尼的衍生物，其活性强于伊马替尼30～100倍，对大多耐伊马替尼的突变有效但不能抑制Src家族激酶和T315I突变。Le Coutre等［14］报道了尼洛替尼治疗伊马替尼耐药或不耐受CML-AP(加速期)患者的疗效。接受尼洛替尼治疗(400 mg，bid)的119例CML-AP患者中获得血液学缓解和细胞遗传学缓解的患者分别为47%和29%，获得血液学缓解和细胞遗传学缓解的中位时间分别为1个月和2个月。12个月预期总生存率为79%。达沙替尼是一个Abl与Src家族双向激酶抑制剂，对Abl/Src激酶有高度选择性，对bcr/abl融合基因阳性细胞株的抑制作用比伊马替尼强100～300倍，降低bcr/abl磷酸化活性的作用比伊马替尼强1000倍。目前已报道的ABL激酶点突变超过100种，除T315I突变外，达沙替尼对其中许多突变都有临床疗效［15］。目前，达沙替尼已被美国美国食品药品管理局批准用于治疗伊马替尼耐药或不能耐受的CML患者。

第三代bcr/abl激酶抑制剂是Aurora激酶抑制剂，与第二代酪氨酸激酶抑制剂最大不同是具有ABLT315I突变特异结合能力，能克服T315I突变导致的耐药，主要用于治疗伊马替尼及对第二代bcr/abl酪氨酸激酶抑制剂耐药的T315I突变者。

2．3 逆转MDR MDR是肿瘤细胞最重要的耐药形式之一，它表现为细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他许多结构不同、作用机制不同的抗肿瘤药物也产生耐药性。齐静等［16］采用反转录-聚合酶链反应及流式细胞术分别从mRNA及蛋白水平检测了伊马替尼耐药细胞系K562/G01的MDR水平，发现K562/G01有15．67%MDR表达，MDR参与了伊马替尼耐药发生。随着人们对MDR形成机制研究的深入，逆转MDR的作用靶点也逐渐从P-gp本身转向其编码基因MDR1。目前，药物对抗MDR1/P-gp介导MDR的方法有:①化疗药物合用P-gp抑制剂;②增加化疗药物脂溶性使药物迅速被吸收;③调节信号通路，抑制P-gp表达等。

2．4 bcr/abl下游通路抑制剂 在bcr/abl的众多下游信号途径中，能作为靶点的包括JAK/STAT、PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK。靶向Ras途径的药物有法尼酰基转移酶，如Lonafarnib，已经证实能成功地抑制野生型bcr/abl下游Ras信号途径以及T315I突变细胞系，并且增强了伊马替尼对早期慢粒原始祖细胞的细胞毒性［17］。在众多PI3K/AKT信号抑制剂中，雷帕霉素和它的衍生物(RAD001)已被证实能提高伊马替尼对bcr/abl过度表达的细胞和伊马替尼耐药细胞的抑制效应［18］。索拉菲尼是近年来研究较多的药物。它是一种多激酶抑制剂，最初设计为Raf(丝裂原活化蛋白激酶信号转导的关键调节者)激酶抑制剂，后来研究发现其能同时抑制其他多种酪氨酸激酶，如血管内皮生长因子、血小板衍化生长因子、受体酪氨酸激酶c-Kit、Fms样酪氨酸激酶等多种受体酪氨酸激酶［19］。有研究显示，索拉非尼联合雷帕霉素、Bcl-2抑制剂GX15070可在体外诱导伊马替尼耐药细胞株凋亡［20］。

2．5 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 体外和体内试验证实，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)有广泛的抗白血病细胞活性，包括阻断细胞周期、抑制细胞增生、诱导细胞分化、激发细胞凋亡。迄今为止，多种HDACi(如辛二酰苯胺氧肟酸，曲古菌素A、丙戊酸钠等)已进入血液系统恶性肿瘤和实体瘤临床试验阶段，这些药物不仅单独使用可表现出抗肿瘤作用，有的还联合其他药物(如维甲酸等)起到协同作用，而且还能增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性，使部分肿瘤耐药现象得到显著改善［21］。Nguyen 等［22］报道，HDACi(如 vorinostat或entinostat)能增强新型酪氨酸激酶抑制剂KW-2449对伊马替尼耐药的细胞作用，诱导其凋亡，其作用存在着时间和浓度依赖性。Zhang等［23］研究还显示，HDACi和伊马替尼联用可以有效地诱导对伊马替尼耐药的CML中静止的前体细胞凋亡，还可以清除植入免疫缺陷大鼠体内的CML干细胞。HDACi可以有效清除接受酪氨酸激酶抑制剂治疗的CML患者体内的白血病干细胞。因此，HDACi是一类很有发展前景的药物。

其他方法如蛋白酶体抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的抑制剂等均在研究中。

3 结语

甲磺酸伊马替尼的耐药机制相当复杂，不仅涉及融合基因本身的结果和表达异常，还涉及多个基因/蛋白以及传导通路的异常，新的机制也在不断地被提出，但目前仍未完全阐明其耐药机制。相信随着对其耐药机制研究的不断深入，对逆转耐药的研究也将进一步开展，这有助于进一步提高CML患者的生存质量及长期生存率，也有助于进一步揭示CML的发病机制。

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