神经干细胞移植治疗帕金森病的研究进展

张 磊，陈 墅，檀 琳(综述)，陈良为(审校)

(第四军医大学1口腔医学系学员十一队，2基础部神经生物学教研室，西安710032)

帕金森病(Parkinson Disease，PD)是人类常见的神经退行性疾病之一，其发生与多巴胺、蛋白质二硫键异构酶、Parkin基因、PINK1基因和突触核蛋白等有关［1］。病理变化较为明确的表现是残存神经元细胞内Lewy小体形成、胶质增生以及黑质、苍白球区的多巴胺能神经元的变性、缺失，导致脑内多巴胺能神经递质相对减少［2］。其临床主要表现为静止性震颤、肌肉僵直、运动障碍、特殊姿势等，同时伴有大量的精神症状，如抑郁、淡漠、焦虑、幻想、妄想、痴呆等。目前PD无明确的治疗方法，主要有药物治疗、外科手术治疗、神经干细胞(neural stem cells，NSCs)移植治疗三种方法。其中NSCs移植治疗PD具有广泛的应用前景。

1 PD的治疗现状

药物治疗是PD治疗的一种重要方法。PD治疗的药物至今已经发展到了第四代，有抗胆碱能药、抗组胺药、左旋多巴类药、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B抑制剂、儿茶酚胺氧位甲基转移酶抑制剂等［3］，但目前治疗PD最有效的方法依旧是左旋多巴的替代治疗。左旋多巴治疗PD可使得患者的生活质量明显改善、寿命延长、降低病死率，但其在治疗过程中会出现严重的不良反应。目前国外学者主要把治疗PD药物的不良反应分为两类:①Ⅰ型不良反应。这类不良反应的出现可以用药物的药理学特性解释，临床医师是可预测的。出现频率高，有剂量依赖性，通常无致死性。如左旋多巴在外周引起的恶心、呕吐、腹痛、厌食及心率失常等症状，在中枢引起的幻视和症状波动以及异动症等。它们通常与左旋多巴在消化系统、心血管系统和中枢神经系统的过度作用有关。②Ⅱ型不良反应。这类不良反应发生机制与药物的药理作用无关，通常也不可预测，如儿茶酚邻位甲基转移酶抑制剂引起的腹泻和肝毒性，麦角碱类多巴胺受体激动剂引起的脱发、胸腹膜纤维化、红斑性肢痛症等［4］。

目前外科治疗PD的方法主要有两种:脑内核团毁损术和脑深部电刺激术。近年，脑深部电刺激因其微侵袭性、可调节性、可逆性、疗效持久等优点已逐渐替代了毁损术。脑深部电刺激是采用立体定向手术将微电极植入患者的脑内靶点，并采用高频电刺激改变相应核团兴奋性，从而改善PD症状的一种微创神经外科手术方法［5］。但是，脑深部电刺激治疗PD易出现并发症，易出现术中并发症，主要可表现为颅内出血和(或)感染。刺激相关并发症，可出现肌肉收缩、眼球运动障碍、感觉障碍、肢体麻木等。此外，当脑深部电刺激设备出现问题时亦可出现相关并发症。

2 NSCs移植治疗PD

近年来，研究发现哺乳动物中枢神经细胞并非不可再生，如NSCs常处于静止状态，只有在损伤后才受到刺激活跃增生，多数情况下，这些细胞都会向星形胶质细胞的方向分化，参与局部的瘢痕形成［6］。随着NSCs鉴定、诱导、迁移、整合等技术的成熟，NSCs替代治疗PD等神经变性疾病成为可能，极具发展前景和应用价值。

2.1 NSCs 是指具有自我更新能力，多向分化潜能力，并具有提供一定量脑组织能力的一组细胞群，在一定条件下可分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。成人的NSCs主要存在于海马齿状回下分子层和前脑的室管膜下区、纹状体、嗅球是NSCs发生的主要区域。在我国用于移植治疗PD的NSCs主要是从患癫痫、脑瘤或创伤的患者外科手术时切除的部分脑组织中分离获得的，然后再通过不同的外科技术来加以分离［7］。NSCs的特点:①回归特性。在NSCs移植过程中，它有向着其起源部位，或功能及解剖区域的特殊趋化作用，有助于移植后的替代作用。②平均迁移性。NSCs移植后，逐渐向密度较小的区域迁移，有助于移植后作用的发挥。③增殖分化性。NSCs后在适当的微环境下，可以增殖分化为特定细胞，包括神经系统三类主要细胞——神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，能为中枢神经移植提供大量的细胞供体源［8］。

2.2 NSCs的移植策略 PD的主要病理过程为黑质-纹状体内的多巴胺能神经元变性，进而导致多巴胺递质分泌减少。在20世纪中期，Lindvall等［9］首次将含多巴胺能神经元的胚胎脑组织移植入PD患者的纹状体，替代退变的黑质多巴胺能神经元，结果发现能部分改善患者的临床症状，之后利用NSCs治疗PD的研究便逐渐兴起。目前，NSCs治疗PD的策略主要由以下三种。

2.2.1 NSCs在体外分离培养后直接移植 在体外分离培养NSCs之后，直接移植到纹状体，并在特定的环境信号、细胞因子等的共同作用下诱导成为黑质多巴胺能神经元。郑敏等［10］通过体外单克隆法培养分离NSCs，利用免疫细胞化学检测多向分化潜能及特异性标记巢蛋白。并将脒基苯基吲哚标记的NSC植入建立的PD大鼠模型中，检测6-羟基多巴胺诱发的旋转行为、荧光检测标记细胞的分布情况，免疫细胞化学和高效液相色谱检测细胞分化和神经递质水平，结果显示NSCs在脑内迁移，并在纹状体内形成少量酪氨酸羟化酶阳性细胞。植入后纹状体内多巴胺及其代谢产物水平上升，说明NSCs在体外大量扩增后植入PD脑内能长期存活并分化、分泌神经递质，从而部分改善PD症状。

2.2.2 NSCs在体外培养诱导后移植 NSCs体外培养、增殖、诱导分化为特定的黑质多巴胺能神经细胞或黑质多巴胺能神经前体细胞，再进行移植［11］。NSCs在增殖时形成表达中枢神经系统祖细胞标记免疫活性的细胞球。在包含有白细胞介素1b、白细胞介素11和胶质源性神经营养因子等分化介质中可形成酪氨酸羟化酶免疫活性的细胞，这些细胞表现为多巴胺能神经元的形态学和功能的特性，包括多巴胺的产生和释放［12］。有研究者利用体外培养将NSCs大量增殖，并将其诱导分化为多巴胺能神经元，然后将其植入PD模型大鼠模型中，结果发现PD大鼠的运动功能明显改善。

2.2.3 NSCs移植联合基因治疗策略 酪氨酸羟化酶基因、孤儿核受体基因、肿瘤抑癌基因、胶质源性神经营养因子基因等修饰NSCs移植治疗PD是近年来兴起的热点，而酪氨酸羟化酶是多巴胺合成的限速酶，是PD基因治疗最早选择的目的基因。Ryu等［13］将酪氨酸羟化酶、鸟苷三磷酸环化水解酶1联合基因修饰的C17.2系NSCs移植到PD鼠模型纹状体中，发现NSCs能够很好地存活、迁移和分化，并能明显地改善动物行为。徐胜利等［14］将人胶质细胞源性神经营养因转染的大鼠NSCs移植于PD模型大鼠模型中，发现胶质源性神经营养因子基因修饰NSCs移植能有效改善损伤黑质-纹状体的多巴胺系统功能。Huot等［15］用孤儿核受体转染NSCs后能够很好地分化为多巴胺能神经元，存活一段时间后，整合到帕金森小鼠的纹状体内，并且能够很好地逆转小鼠动作的缺陷。

2.3 促进内源性多巴胺能神经发生 离体NSCs的增殖和分化受到多种神经营养因子的影响，如成纤维生长因子、表皮生长因子。在这些因子的作用下，NSCs能够分化为神经元或者是胶质细胞，可激活内源性NSCs迁移到纹状体。利用存在于成年哺乳动物脑内存在的NSCs，刺激它们在脑内增殖、迁移，并建立适宜的微环境，使之最终分化为黑质多巴胺能神经元，并与周围的突触建立联系［16］。

2.4 NSCs治疗PD面临的临床问题 成功的NSCs移植治疗PD的方法要想成功必须解决以下几个问题:①移植后的细胞在宿主组织中长期存活问题。②移植后细胞能够定向分化为成熟的多巴胺能神经元，并且具有成熟多巴胺能神经元的分子学和组织学的特性［17］。③移植后细胞能够释放规定种类的多巴胺。④能够长期逆转PD患者的动作缺陷。⑤最小程度的不良反应，如异动症。⑥最大程度地减少肿瘤的形成。在动物模型研究报道中，NSCs的分化中多巴胺能神经元较为缺乏，而有相当一部分NSCs分化为肿瘤细胞，这对于多巴胺能神经元缺乏的PD的治疗来说十分不利［18］。

4 结语

随着分子生物学技术等的快速发展以及PD研究的不断深入，NSCs移植治疗PD在不远的将来一定能够取得重大的发展和突破。2006年，Takahashi等［19］通过反转录病毒将 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc导入小鼠胚胎成纤维细胞，筛选出了与小鼠胚胎干细胞非常相似的细胞系，并将其命名为诱导多功能干细胞。2007年Takahashi等［20］利用相同的技术获得了人类诱导多功能干细胞。Soldner等［21］研究小组利用慢病毒将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc插入基因组中，成功诱导帕金森综合征患者皮肤成纤维细胞转化为诱导多功能干细胞，并将其诱导分化成为多巴胺能神经元细胞，取得了重大突破。如果能将诱导多功能干细胞研究中的相关技术应用到NSCs研究中去，可能会取得很好的效果。

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