感觉神经末梢形态学研究方法及其在躯干和四肢软组织中的研究进展

王永志(综述)，李 丽(审校)

(首都医科大学附属北京友谊医院中医科，北京100050)

神经形态知识的逐步深入，有赖于研究方法的不断发展与改进，建立在中枢神经系统上的银染法、免疫组化法和神经顺行示踪法等，同样适用于针对感觉神经末梢(sensory nerve ending，SNE)的研究。这样，在SNE形态学基础上，研究者可以对躯体神经干、神经分支在其走行过程中，由于某些原因受到慢性损伤引起的局部疼痛、压痛、感觉异常等系列神经功能障碍进行阐释。

1 SNE分类

神经末梢一般是指周围神经纤维轴突的终末，它分布于全身各种组织和器官中。神经末梢包括接受体表和内脏感觉传入的SNE以及支配肌肉或腺体等效应器官的运动神经末梢。临床上各种感觉的产生均来自于SNE，其形态结构不同，种类甚多，根据形态学观点可将其归结为游离的神经末稍和有被囊的神经末稍两种［1］。

1.1 游离神经末稍 构成游离神经末稍的多是Aδ类及c类神经纤维。真皮内的神经纤维于不同深度反复分支，并失去髓鞘，形成裸露的轴突末稍，分布在表皮细胞之间，几乎抵达角质层。每个末稍分布于表皮1至数毫米范围，彼此重叠交错，使皮肤具有很高的敏感性。筋膜、韧带、骨膜、脑膜、肌键、关节囊等处也有游离神经末稍，一般认为它们大都是伤害感受器，各种不同性质的刺激达到一定强度，就成为伤害性刺激，都能引起痛觉。目前研究认为，这种与伤害刺激有关的游离神经末稍即是痛觉感受器。痛觉感受器在很多情况下是一种化学感受器，当组织受到损伤时，感受器周围微环境的化学性质发生改变，例如，损伤组织释放出组胺、5-羟色胺、缓激肽、前列腺素和钾离子等各种致痛物质，作用于游离神经末稍，达到伤害性刺激的程度，从而引起传入冲动，进入中枢神经系统，引起痛觉。

1.2 有被囊神经末稍 此类神经末梢包以结缔组织成分组成被囊，种类很多，大小不一。它们大都有快适应的特点。目前研究比较多的有环层小体、触觉小体、Ruffini小体和肌梭等。环层小体感受压觉和震动觉，触觉小体感受触觉，Ruffini小体是一种机械感受器，而肌梭的功能则主要和肌肉活动相关。目前尚未发现这些感受器和疼痛有直接关系。

2 SNE形态学研究方法

在神经解剖学研究中，1903年西班牙人建了Cajal法［1］，首次显示了神经元内的神经原纤维及轴突末梢，并因此荣获诺贝尔奖。至20世纪末，各种研究方法层出不穷，神经末梢的研究作为分支之一，同样适合用这些方法进行形态学的观察。

2.1 Cajal法 1903 年的 Cajal法［1］，首次显示末梢与其他神经元胞体间的连结不是连续的，而是接触的，并由此建立了神经元学说，即神经元既是一个形态单位，又是一个功能单位。这个学说奠定了现代科学对神经系统研究的基础。以后各改良方法相继出现，Cajal吡啶银染色法显示神经原纤维、神经末梢及外周神经的再生过程效果良好，但也存在一定的不足［2］，如对标本的选择要求非常严格，手术切除离体后，立即取材，同时浸入吡啶液固定，否则神经原纤维、神经末梢及周围游离神经易于变性，影响其显示。

2.2 溃变轴突与终末镀银法 1890年的Marchi法因其不能染轴突及其终末，溃变的时间有限，已被淘汰。1946年的Gless终末镀银法可发现终末前变性，是顺行追踪该核团的投射情况及终止区的独到的方法，一直为神经解剖学研究者所使用。该方法的主要缺点是在核团损伤时，针道损伤的纤维也可染出，干扰了研究结果。因此自辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)法出现以后，近年来此法很少被应用。目前在银染法中改良Bielschowsk神经末梢染色法较为理想，最大特点是在镜下可控制其反应程度或效果。神经组织的浸染，最细的末梢也能清晰显示出，而结缔组织着色很淡［3］。

2.3 放射自显影法 放射自显影神经追踪(autoradiographic nerve tracing，ARNT)法是20世纪60年代后期，Lasek等将放射自显影术用于神经元投射途径的研究时建立的。自从1972年 Cowan等首先用ARNT法研究中枢神经系统的纤维联系以来，该法在神经科学界得到广泛应用，逐渐成为追踪神经纤维联系的主要技术之一。该法的问世，是神经形态研究方面的又一创新。ARNT法基于轴浆运输的机制。神经元的胞体都能合成蛋白质，并通过轴浆来运输，胞体在合成蛋白质时，对氨基酸是有选择性的摄取和运输的。因此，用放射性核素标记的氨基酸，被胞体摄取合成蛋白质后沿着轴浆的运输路径可通过显影来进行观察。该种方法比较灵敏，最大优点就是不标记过路纤维，克服了HRP法和神经纤维溃变法标记过路纤维的缺点。但注射范围小，对广泛起源的通路不适用，而且需要较长时间才能观察结果，若有伪像与错误不能及时得以校正，费时又费力，近年来也少被应用。

2.4 顺行示踪法 HRP示踪法［4］:1971年，Kristenson和Olsson首先报道HRP可被神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技术，即HRP法。HRP法的基础是轴浆运输，轴浆运输是神经元的一项基本活动，即沿其轴突有从胞体向末梢(顺向)及从末梢向胞体(逆向)的物质转运。HRP法建立的早期，仅用于逆行追踪，即将HRP注入神经的末梢部位，经逆行轴浆运输至胞体，再通过酶组化染色显示。以后的实验证明，HRP也可用于顺行运输，即将HRP注入神经元胞体所在部位，HRP可顺向运送至末梢部位。此后，为提高HRP本身的灵敏度而有一些结合HRP的产生，如麦芽凝集素结合HRP、霍乱毒素B结合HRP、去霍乱毒素结合HRP、菜豆凝集素结合HRP等。HRP方法的问世，在神经科学研究领域中极富价值，它结束了自Marchi(1886年)开始长达一个世纪的唯用银染法追踪溃变纤维的年代，在神经束路追踪的形态及功能研究中具有划时代的意义。至今，HRP追踪技术已可运用于逆行追踪、顺行追踪和跨节转运。HRP的缺点是在中枢注射区有向周围扩散现象，可采用微量注射或微电泳导入技术加以克服。而其究竟能被末梢摄取的有效范围有多大，至今尚无十分准确的判断标准。

葡聚糖是由肠系膜明串珠菌产生的多聚体，分子量有大有小，用于示踪的葡聚糖相对分子质量一般为3×103。葡聚糖与不同的标志物结合形成各种追踪剂。较常用的有四甲基罗达明葡聚糖胺和生物素葡聚糖胺(biotinylated-dextran amine，BDA)，两者均可用于顺行和逆行追踪，但BDA的顺行追踪结果优于逆行追踪。BDA与卵白素之间有特别强的亲和力，常用结合了过氧化物酶或荧光素的卵白素与之孵育结合，通过组化反应或荧光显微镜观察显示标记结果。葡聚糖追踪法的优点是:注射部位局限，动物存活时间较短，显示反应程序简单，灵敏度高，能进行多重顺行追踪标记。

2.5 荧光组织化学及免疫组织细胞化学法 1962年Falck-Hillarp发现了甲醛诱发荧光法，此法可使神经元内所含的单胺类物质与醛聚合成新的环形化合物，在荧光显微镜下发射出波长不同的荧光。用荧光显微镜观察，儿茶酚胺末梢和细胞呈绿色荧光。5-羟色胺神经元及末梢呈黄色荧光。此法用甲醛蒸气，需冷冻干燥装置，比较麻烦。1972年瑞典学者Bjorklund和Lindvail创立乙醛酸诱发荧光法，手续简便，也得到同样效果。至今已有许多改良的技术，使该技术的敏感性和特异性大为提高。

20世纪70年代至今，免疫组织化学方法广泛应用于神经解剖学的研究，它利用制备的特异性抗体血清(或单、多克隆抗体)与神经组织或细胞中相应的抗原结合。把相应的抗原诸如 PGP9.5［5，6］、降钙素基因相关肽、P物质［7］等作为标志物，显示不同功能的神经纤维阳性反应。此结合的显示有直接法和间接法。直接法步骤简便、特异性强、敏感性差。间接法显示抗原抗体结合物的灵敏度高，一般用羊抗兔作为第二抗体与第一抗体上的抗原结合，或用荧光素与第二抗体结合，也可用灵敏度高的HRP或卵白素生物素过氧化物酶复合体与第二抗体结合，以显示抗原抗体结合物在神经细胞体或其神经末梢的存在。

3 躯干四肢SNE形态学的研究

SNE广泛分布于身体各个部位，本文仅对临床上四肢和躯干易于发生软组织疼痛的部位按解剖层次进行分述。

3.1 皮肤内 SNE 的研究 Cauna［8］应用 Bielscho wsky神经末梢染色法于光、电镜下研究人手指皮肤游离神经末梢的精细形态，实验未麻醉，于指部直接活检取材。研究中见有大量形态不同的游离神经末梢分布于指部，光镜下计数换算后每1 mm2约有各形态轴突末梢250个。末梢多垂直于皮肤表面，每一末梢支配一定表面区域，与临近末梢不重叠，这样的结构具备更好的精细触觉和两点辨别觉。这一点明显不同于有毛皮皮肤的神经末梢分布。该方法的缺点是在材料的选择上，对显示游离神经末梢的选材以人的口唇或小白鼠上唇为好，触觉小体的选材以人指尖掌侧为好，这使得此方法有一定局限性，同时本方法不适于大批标本的制作［9］。

Marfurt等［10］通过在SD大鼠三叉神经节内注射HRP追踪其顺行运输分布部位，在24～48 h内分别处死各组大鼠，常规组织取材，切片、四甲基联苯胺显色，光镜下观察。HRP可被运输到各个神经末梢，在角膜、触须毛囊、牙髓、牙周组织、面部皮肤均可见其踪迹，在其轴突及末梢内比较密集，能够清楚地显示标记结构的位置和形态。Marfurt认为，本法标记后比较容易将神经纤维和末梢与其他组织区分，结果优于银染法，因在银染法下，由于其他组织，例如，网状纤维或弹性纤维的嗜银性，使得神经组织不易与之鉴别。在另一项研究再生神经纤维的分布的实验中［11］，研究者采用CB-HRP顺行示踪技术，验证再生纤维的来源和分布。实验中行部分椎板切除术，显露神经节，用玻璃显微吸管将4 μL的2%CBHRP注入神经节，动物存活96 h，以甲醛混合液进行心脏灌注。取下神经节及移植皮瓣存于含10%蔗糖的磷酸缓冲液中12 h，冷冻切片，四甲基联苯胺法进行呈色，光镜下进行观察。经1、2、4、6个月观察证实失神经皮瓣获得神经再支配是依赖植入的神经，而不是周围皮肤内神经的长入。这种方法能区分粗大及纤细的神经纤维，而且由于将CB-HRP注射于脊髓背根节，因此可以了解外周皮肤某一区域内的神经末梢分布情况。

3.2 筋膜SNE的研究 在胸腰筋膜神经分布的研究中，Stilwell［12］发现，比较大的环层小体及类似环层小体的小团状物和高尔基腱器官小体。而Hirsch等［13］仅观察到精细的游离神经纤维和一些没有被囊的末梢复合体。鉴于当时实验条件限制，这些研究主要应用的是硝酸银浸染及亚甲基蓝染色，没有能够特异地对神经组织进行染色。

针对这种情况，Yahia等［14］在1992年应用免疫组织化学技术来研究胸腰筋膜神经分布，通过对神经丝蛋白及S100蛋白血清抗体免疫化学染色，对患者术后胸腰筋膜进行研究，光镜下除发现游离神经末梢外，同时观察到两种机械感受器(Ruffini末梢及环层小体)，研究中对神经丝蛋白只观察到阳性神经束，未见其他末梢小体结构，而针对S100蛋白抗血清则观察到Ruffini末梢及环层小体。说明两种不同的方法适用于不同的感觉神经组织结构。采用神经组织化学方法［15］，通过乙醛酸诱发荧光法对家兔颈椎前软组织内肾上腺素能神经、胆碱能神经进行观察。结果在椎前筋膜内观察到肾上腺素能纤维有广泛的分布;乙酰胆碱酯酶阳性纤维少量散在于其间。从形态学上证明颈椎前软组织内存在大量的交感神经末梢。另一项研究中［16］采用放射性核素示踪技术，对注入家兔颈后交感神经节的核素32P顺行追踪到颈椎前软组织，观察到交感神经有分支分布到颈椎前纵韧带和椎前筋膜。

3.3 肌肉SNE的研究 肌组织中除肌张力感受器外，75%骨骼肌的感觉神经来自肌筋膜中的游离神经末梢，走行于肌纤维和血管之间，属于有髓的Aδ和无髓的C纤维，是肌伤害感受器。Marina［17］观察到机体的肌肉伤害感受器属机械感受性，阈值低于肌痛阈。在小鼠皮大肌降钙素基因相关肽免疫反应(calcitonin gene-related peptide immunoreactive，CGRP-IR)神经纤维分布的研究中［18］，针对小鼠皮肤进行整装铺片、石蜡切片、CGRP-IR卵白素-生物素-酶复合物染色法(ABC法)染色。光镜下观察，皮肤整装铺片上可见到真皮及皮大肌CGRP-IR神经纤维网，皮大肌的CGRP-IR神经纤维与肌纤维形成运动终板。应用Sihler染色法，观察到家兔不同形态肌的肌内神经分支分布与肌纤维排列有关;肌内神经分支走行有与肌束平行和(或)垂直两种形式［19］。Sihler染色法早年用于染肌梭，后经改良，目前已成为研究骨骼肌肌内神经的重要方法。其优点是在不损伤肌外形的情况下，清楚地显示了原来肉眼不能见到的肌束与肌内神经分支的三维关系，为神经肌肉移植、电生理研究等提供了可靠的形态学依据［20］。

4 结语

目前对临床中常见的各种躯干、四肢软组织疼痛的研究，大多集中在血生化及电生理学等方面，而在组织学上，疼痛的感觉终器主要由感觉神经末稍引起，那么在病变后其形态学如何变化，目前在基础研究中这一点备受关注。SNE形态的研究，大多建立在基本神经形态学研究方法之上。在具体研究中根据研究课题的需要，可以几种方法结合，如银染法、双重荧光素标记或标记后又进行免疫组化反应、HRP法与免疫组化法结合等，这样既能了解神经末梢分布情况，又可知道其细胞的化学性质，为阐明某一病变提供形态学基础。

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