榅桲子总黄酮提取工艺研究*

哈及尼沙，地力夏提·艾比布拉，美丽万·阿不都热依木，阿吉艾克拜尔·艾萨

(1.中国科学院新疆理化技术研究所，乌鲁木齐 830011;2.中国科学院研究生院，北京 100049;3.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830054)

榅桲(Cydonia Oblonga)是维吾尔医常用的具有浓郁的地方民族色彩的传统维药。榅桲子有强化皮肤保湿力，光滑皮肤，退烧，止咳，降低干躁等作用［1-4］，在维吾尔医中常用主治干热性或胆液质性疾病，如:发热舌燥、伤寒、肺结核、咳嗽、感冒、肠疡腹泻等［5］。据文献报道［6-8］，榅桲子含有黄酮类及酚类成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗溃疡和抗肿瘤等活性。目前笔者还未见该药材总黄酮含量测定及提取工艺研究的报道。为了该药材的进一步研究，在参考《中华人民共和国药典》及文献中总黄酮测定方法的基础上［9］，采用乙醇提取，紫外可见分光光度法首次测定维药榅桲子中总黄酮含量，得到最佳提取工艺条件。

1 仪器与试药

1.1 仪器 电子天平(北京赛多利天平有限公司)，UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，XMT-DA型电子恒温水浴锅(余姚市亚星仪器仪表有限公司)。

1.2 试药 芦丁化学对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100080-200707，纯度:92.5%)，亚硝酸钠(天津市福晨化学试剂厂)，氢氧化钠(天津市红岩化学试剂厂)，硝酸铝(天津市福晨化学试剂厂)，无水乙醇(天津市红岩化学试剂厂)等试剂均为分析纯。

榅桲于2009年10月采自新疆克拉玛依州上阿图什乡，榅桲子从该新鲜成熟榅桲果实中分离、室温下干燥。将干燥种子粉碎，过筛孔内径(180.0±7.6)μm(80目)筛，得榅桲子粉末。并由新疆维吾尔自治区药品检验所苏莱曼主任药师鉴定为榅桲子。

2 方法与结果

2.1 榅桲子总黄酮的测定

2.1.1 标准曲线的绘制 精密称取芦丁标准品25 mg，加75%乙醇超声完全溶解，定容至100 mL量瓶中，摇匀，制成浓度为0.250 mg·mL-1的标准品溶液。分别精密吸取标准品溶液 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 和7.0 mL置于25 mL量瓶中，各加5%亚硝酸钠0.5 mL，放置6 min后，加8%硝酸铝0.5 mL，放置6 min，再加1 mol·L-1氢氧化钠 5 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以不加标准品的溶液作空白，取中等浓度的标准溶液在400～800 nm波长范围进行扫描，在506.5 nm波长处有最大吸收。最大吸收波长处测定各标准溶液的吸光度值，以吸光度(Y)为纵坐标，浓度(X，mg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线。用计算机进行线性回归，得芦丁质量浓度和吸光度的关系为:Y=7.754 5X+0.066 3，r=0.999 7。在吸光度＜0.5的范围内，吸光度和浓度保持较好的线性关系。

2.1.2 榅桲子总黄酮含量的测定 称取一定量榅桲子粉末，用适量75%乙醇回流2 h，抽滤后滤液置于50 mL量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，摇匀。取此样品液5.0 mL置于25 mL量瓶中，然后按“2.1.1”方法测定提取液的吸光度，通过标准曲线计算得到样品总黄酮的含量。总黄酮含量=榅桲子中总黄酮提取量/榅桲子质量。

2.2 单因素实验及水平考察 将原料榅桲子粉末按1∶10～1∶35(倍)的料液比加入浓度为55% ～95%乙醇溶液，然后在温度30～70℃条件下提取0.5～3 h，1～4次，每次改变其中1个因素，分析该因素对提取量的影响。用单因素实验来确定总黄酮最佳提取条件。

由于各因素之间有相互交叉影响，因此要全面考虑乙醇提取法的工艺参数，采用L9(34)正交设计表安排实验，以总黄酮提取量作为主要考察指标。

2.3 实验与结果

2.3.1 乙醇浓度对提取量的影响 精密称取榅桲子5份，每份5.00 g，分别取体积分数为55%，65%，75%，85%和95%乙醇溶液各100 mL，在60℃水浴中回流提取2 h，趁热过滤，冷却后，按照“2.1.2”方法计算黄酮含量，结果黄酮含量分别为 4.00，10.25，10.50，7.75 和5.75 mg·g-1。实验结果表明:随着乙醇浓度的增加，总黄酮含量降低。低浓度乙醇中水分含量较多，可促进植物在水中的膨胀，提高植物和溶剂的接触面。从实验中也可以看出:乙醇浓度为75%时黄酮含量最高，所以75%乙醇选为最佳乙醇提取浓度。

2.3.2 提取时间对提取量的影响 精确称取榅桲子药材粉末6份，每份5.00 g，在料液比为1∶20的提条件下，加75%乙醇溶液，在60℃水浴中分别回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 和 3.0 h，趁热过滤，冷却后按照“2.1.2”的方法计算黄酮含量，结果黄酮含量分别为6.75，8.00，8.25，9.50，9.75 和8.25 mg·g-1。实验结果表明:当提取时间为2.5 h时，提取效果最好。而当时间继续延长时，总黄酮含量反而降低。这可能是由于提取时间太长，部分乙醇被挥发而导致溶液沸点逐渐增大，从而破坏某些黄酮类化合物。

2.3.3 料液比对提取量的影响 精确称取榅桲子药材粉末6份，每份5.00 g，分别加75%乙醇溶液，料液比(倍)分别为 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 和1∶35，在75℃水浴中回流提取2 h，趁热过滤，冷却后，按照“2.1.2”的方法计算黄酮含量，结果黄酮含量分别为 6.25，9.50，5.25，6.50，6.75 和 7.00 mg·g-1。从实验结果可知:料液比1∶15(倍)时总黄酮提取量最高，因此选择料液比1∶15(倍)为最佳提取料液比。

2.3.4 提取温度对提取量的影响 精确称取榅桲子药材粉末7份，每份5.00 g，乙醇浓度为75%，料液比为1∶15，分别在30，40，50，60，70，80 和 90 ℃恒温水浴中回流2 h。趁热过滤，冷却后，按照“2.1.2”方法进行黄酮含量的测定。结果黄酮含量分别为2.25，3.75，5.75，8.25，9.00，5.55 和 7.25 mg·g-1。实验结果表明:70℃时总黄酮含量最大，黄酮在乙醇中的溶解度随着温度的升高而增大，但温度＞70℃时发现含量走势不稳定。温度太高有可能破坏黄酮类化合物的结构，可能溶剂挥发率增加而影响黄酮的提取量，所以初步选70℃为最佳提取温度，进一步用正交实验来确定最终提取温度。

2.3.5 提取次数对提取量的影响 精密称取榅桲子药材粉末4份，每份5.00 g，以75%乙醇溶液为提取溶剂、料液比为1∶30下，分别在70℃恒温水浴中回流1，2，3和4次，每次2 h。趁热过滤，冷却后按照“2.1.2”的方法进行黄酮含量的测定，结果黄酮含量分别为1.50，5.75，6.50和6.50mg·g-1。实验结果表明:提取2次以上时总黄酮提取率明显增高，提取3次时总黄酮含量最高与提取4次的总黄酮含量差别不大，为了节约提取时间选择提取3次为最佳的提取次数。

2.4 正交实验设计及结果 榅桲子总黄酮的提取量受到很多因素的影响，根据单因素预实验分析，发现提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)、乙醇浓度(D)对榅桲子总黄酮的提取量均有影响。由于各因素之间有相互交叉影响，要全面考虑乙醇提取法的工艺参数。通过以上单因素实验，找出最佳单因素，在最佳单因素数据的基础上，采用L9(34)正交设计表安排实验，以总黄酮提取量作为主要考察指标。因素和水平见表1，实验方案及结果见表2，方差分析见表3。

表2 L9(34)正交设计实验的结果Tab．2 Results of L9(34)orthogonal test

表3 4因素方差分析Tab．3 Variance analysis of 4 factors

从表2中的 K1，K2，K3，R 分析得到:乙醇浓度，提取时间，料液比，提取温度4种因素对榅桲子总黄酮提取的影响程度依次为:乙醇浓度 (D)＞料液比(C)＞提取时间(B)＞提取温度(A)。比较各因素的极差R可知，料液比和乙醇浓度的极差较大，说明它们对总黄酮的提取量影响较为显著;而提取时间和提取温度的极差较小，说明对总黄酮提取量的影响较小。总黄酮的提取量随乙醇浓度先升高，而后有所下降，在75%时提取量最高，浓度＞75%时提取量下降，可能是由于乙醇浓度过大时，在加热条件下，溶剂挥发从而较多损失的缘故。

由表3可知，料液比和乙醇浓度在置信度95%水平上对提取量影响显著。通过以上综合分析，结合单因素实验和极差分析，确定最佳提取工艺为A2B3C1D2，即提取温度为60℃，提取时间2.5 h，料液比1∶10，乙醇浓度75%，提取3次。

2.5 验证实验 按照正交实验确定的最佳工艺:提取温度为60℃，提取时间2.5 h，料液比1∶10，乙醇浓度75%的条件下，重复3次进行实验，得到的平均提取量为13.60 mg·g-1。3次重复实验的结果之间相差很小，说明该工艺稳定可靠，可作为有机溶剂提取榅桲子的最佳工艺。

3 讨论

根据单因素实验，确定榅桲种子中总黄酮的提取条件为:乙醇浓度75%，提取时间2.5 h，料液比1∶15，提取温度70℃，提取次数3次。各因素之间有相互交叉影响，在单因素实验结果的基础上采用L9(34)正交设计实验，考虑乙醇提取法的工艺参数。正交实验结果显示，影响总黄酮提取量的因素主次顺序为:乙醇浓度＞料液比＞提取时间＞提取温度。确定提取条件为75%乙醇作溶剂，料液比1∶10，温度为60℃，提取3次，每次提取时间2.5 h，得到榅桲子中黄酮类物质总含量为13.60 mg·g-1。根据验证实验，该提取工艺稳定性好，可靠。

本实验采用分光光度法，以芦丁为标准对照品，测定榅桲子中总黄酮含量，选择最佳提取工艺条件。该方法操作简便，成本低，提取效果好，可用于检测榅桲子中黄酮含量，为该药材的进一步系统研究提供了依据。

(志谢:感谢“中国科学院、国家外国专家局创新团队国际合作伙伴计划”项目和国家杰出青年基金项目的资助)

［1］ 新疆植物志编辑委员会.新疆植物志:第2卷，第2分册［M］.乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社，1995:287.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册［M］.乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社，1999:105.

［3］ 尼米吐拉·艾白都拉，买买提江·马合木提，木塔力甫·艾力.维吾尔医常用药材(维吾尔文)［M］.乌鲁木齐:新疆人民卫生出版社，2005:133.

［4］ 中国医学百科全书编辑委员会.中国医学百科全书·维吾尔医学［M］.上海:上海科学技术出版社，2005:259.

［5］ 阿巴拜克热·热合曼.维吾尔医常用生药［M］.乌鲁木齐:新疆人民卫生出版社，2004:118.

［6］ SILVA B M，ANDRADE P B，VALENTAO P，et al.Quince(Cydonia oblanga Miller)fruit(Pulp，Peel，and seed)and jam:antioxidant activity［J］.JAgric Food Chem，2004，52:4405-4712.

［7］ SILVA B M，ANDRADE P B，FERRERES F，et al.Composition of quinec Cydonia oblanga Miller seeds:phenolics，organic acids and amino acids［J］.J Nat Product Res，2005，19(3):275-281.

［8］ ANDREIA PO，JOSE A P，PAULA B A，et al.Cydonia oblonga leaves phenolics［J］.J Agric Food Chem，2007，55(19):7926-7930.

［9］ 王洪伦，李玉林，索有瑞.白刺种子黄酮类化合物最佳提取工艺研究［J］.食品科学，2004，25(7):97-99.