OTX1基因与遗传性骨性反牙合畸形相关性的研究

田玉楼，刘洁，于方

（中国医科大学1.口腔医学院正畸科，沈阳110002；2.实验技术中心，沈阳110001）

骨性反牙合畸形是常见的颅颌面错牙合畸形之一，是受遗传和环境影响的多基因遗传病，由在口腔面部发育的过程中某些与骨骼发育相关的基因表达异常导致［1］。目前尚无明确的遗传性骨性反牙合遗传易感基因，研究发现goosecoid同源盒基因（goosecoid homeobox，Gsc）、GLI家族锌指2（GLI family zinc finger2，Gli2）、GLI家族锌指3（GLI family zinc finger3，Gli3）、distal-less同源盒基因5（distal-less homeobox5，DLx5）、重组转化生长因子 β2（transforming growth factor-2，TGFβ2）、果蝇 Orthodentide人同源盒基因1（orthodenticle homeobox1，OTX1）等基因在不同的发育阶段对下颌骨的形态发育产生影响［3～6］。本研究根据口腔颌面部发育规律，利用生物信息学手段选择了一个与遗传性骨性反牙合畸形可能相关的候选基因——OTX1（homo sapiens orthodenticle homeobox1），PCR扩增结合测序筛查该基因外显子的突变和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位点的基因型分布，分析其与遗传性骨性反牙合的相关性，为寻找遗传性骨性反牙合易感基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2006年8月至2008年2月到中国医科大学口腔医院正畸科要求矫治反牙合的38例患者，均来自东北地区，家族中至少有2名或以上成员有同类畸形，并经X线头颅定位侧位片测量分析确定为骨性反牙合。抽取3 mL静脉血，2%EDTA抗凝，-70℃留存备用。100例无反牙合畸形的静脉血由中国医科大学遗传学教研室提供，作为正常对照。

1.2 主要试剂

红细胞裂解液、氯仿︰异戊醇（24︰1）、Tris饱和酚购自上海生工生物工程有限公司；蛋白酶K、TaKaRa PCR Amplification Kit、琼脂糖、Genefinder核酸染料购自大连宝生物公司；PCR产物纯化试剂盒购自美国Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 表达序列标签（expressed sequence tag，EST）克隆筛选候选基因：在EST数据库输入易感区域染色体区带信息，查找EST，Blastn分析后进行电子克隆，与基因组数据库比对后进行染色体定位、基因结构和功能预测。

1.3.2 基因组DNA提取：加入红细胞裂解液分离白细胞，蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇法提取基因组 DNA，乙醇沉淀后加入300μLTE（Tris-EDTA，pH7.4）溶液，常温过夜，-20℃保存。

1.3.3 引物设计及合成：利用Primer-BLAST设计引物，由大连宝生物公司合成，具体的外显子位置、引物序列及扩增产物信息见表1。

1.3.4 PCR扩增及测序：反应总体积25 μL，其中基因组 DNA 40 ng，10×反应缓冲液（MgCl215 mmol/L）2.5 μL，dNTP（2.0 mmol/L）2.0 μL，上下游引物（20 μmol/L） 各0.5 μL，Taq DNA 聚合酶1U。95 ℃5 min，95℃30（各引物的退火温度详见表1），72℃1 min，循环32次，72℃延伸8 min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收后送上海生工公司测序。采用荧光素末端标记法，经ABl377型全自动测序仪测定，BioEdit软件分析，并与GenBank数据库进行比对。

1.4 统计学分析

应用SPSS13.0软件进行χ2检验，检测SNP在患者中和正常对照组中的Hardy-Weinberg平衡情况，并统计SNP位点与遗传性骨性反牙合的相关性。

2 结果

2.1 OTX1基因筛选

依据以下标准选择EST：（1）与已知基因同源性＜50%代表未克隆基因；（2）序列长度＞300 bp；（3）尽可能来源于染色体易感区域，并有关于染色体定位信息的说明；（4）序列中不含Alu重复序列。经Blastn比对分析、EST电子延伸和拼接、电子表达谱分析和基因预测筛选到的候选基因，经过编码蛋白质序列性质、功能分析，后续研究中选用OTX1基因。

2.2 OTX1外显子突变筛查

通过PCR扩增，在病例组和对照组8对引物全部扩增出预期大小的片段，经测序筛查了OTX1基因全部5个外显子的突变情况，结果未发现任何突变。

2.3 SNP位点筛查结果

在外显子5发现了一个多态位点，经过和已知的SNP比对后发现该多态位点是rs17850223（表2）。该位点的序列为CACTCACATCACCACCCGCACCAGCT［C/G］AGCCCCATGGCACCCTCCTCCAT GG。rs17850223位点各个基因型的测序结果见图1～3。

2.4 Hardy-Weinberg平衡检验结果

经Hardy-Weinberg平衡检验，病例组和正常对照组OTX1基因rs17850223位点各基因型频率的期望值与观察值如表3所示，吻合度良好，差异无统计学意义（P>0.05），说明群体基因遗传平衡，收集的资料具有代表性，抽样和分型结果是可靠的。

2.5 rs17850223位点的基因型频率和等位基因频率分布

经χ2检验病例组rs17850223位点CG基因型频率为36.85%，高于对照组（17.00%），经统计2者间差异有统计学意义（P<0.05）；病例组CC基因型频率为63.15%，对照组为81.00%；病例组未检测到GG基因型，对照组GG基因型频率为2.00%；病例组等位基因C和G频率为81.57%和18.43%，对照组为89.50%和10.50%，病例组和对照组等位基因频率比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

骨性反牙合畸形具有明显的家族聚集倾向，迄今为止，该疾病的遗传易感基因尚不明确，寻找该疾病的致病基因，阐明它的分子遗传机制具有重要意义。随着人类基因组计划的顺利完成，生物信息数据的不断积累与丰富，定位候选克隆策略成为发现疾病致病基因的重要方法。本研究根据口腔颌面部的发育规律，运用现代生物信息学技术从下颌骨发育的易感区域——D10Mit70和D10Mit136间、D11Mit152和Hba间、D11Mit229和D11Mit163间筛选出包括OTX1在内的12个可能的候选基因。经过编码蛋白质序列性质、功能分析最后选用OTX1进行后续研究。OTX1基因是定位于2p13，含有5个外显子，编码354个氨基酸，广泛分布在骨、神经系统、眼、消化道、肺、卵巢、胰腺等组织，在胎儿、胚胎性组织及干细胞中也有表达［7，8］。文献证实它是脊椎动物大脑发育中至关重要的调控因子，对皮层的发育、结构构建、细胞增殖等起关键调控作用，还和下颌、眼、耳等发育密切相关［9］。但OTX1与遗传性骨性反颌的关系未见报道。

随着第3代遗传标记SNP的广泛确认，其与疾病的关联研究显示出广阔的应用前景。SNP具有以下不可比拟的优点：数量多，分布广泛；具有遗传稳定性；易于基因分型；位于基因编码区的cSNP（coding region SNP）可代表改变遗传机制的候选基因；适于快速、高通量检出。DNA测序是检测SNP的传统方法，具有自动化、高通量的特点，可以检出不确知位点的SNP位置和类型。本研究以OTX1SNP作为遗传标记，利用PCR扩增后直接测序的方法筛查了具有家族遗传倾向的骨性反牙合畸形患者中该基因的编码区突变和SNP多态位点的分布情况，并进行位点连锁不平衡检验。结果显示，OTX1基因全部外显子未发现任何突变，在第5外显子处发现了1个多态位点，经与EST数据库比对，确认该多态位点为rs17850223。经Hardy-Weinberg平衡检验，病例组和正常对照组该位点基因型频率的期望值与观察值吻合度良好，差异无统计学意义，表明遗传符合孟德尔定律，抽样和分组结果可信。病例组CG基因型频率为36.85%，高于对照组的17.00%，二者比较差异具有统计学意义。rs6179位点是一种同义SNP，其密码子的第3核苷酸发生了G/C转换，但编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，仍编码亮氨酸。遗传标记位点和疾病关联的现象可归纳为2种情况：一种是遗传标记本身与疾病的病理发生有关，另一种是致病位点与遗传标记位点存在很强的连锁不平衡。由此推测rs17850223位点可能与疾病的病理发生无关，而是与某一致病基因位点存在很强的连锁不平衡。经SNP的传递不平衡检验，初步证实了OTX1基因可能是遗传性骨性反牙合的易感基因，但关于rs17850223多态位点与遗传性骨性反牙合的连锁分析还应进一步扩大样本，采用核心家系加以验证。

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