动物园珍禽舍内大肠杆菌的分离鉴定与耐药性的试验

伍清林,金兰梅,周正凯,邓长林,徐 雪,徐 蕾,李晓峰

(1.金陵科技学院动物科学与技术学院,江苏南京210038;2.南京红山森林动物园,江苏南京210037)

大肠埃希氏菌是人和动物肠道中的一种共栖菌,在特定条件下可致大肠杆菌病,并能够随着粪便排出而污染环境。大肠埃希氏菌在空气中,特别在动物舍及其周围环境中是一种常见菌。在珍禽养殖中大肠杆菌病也常有发生,据报道[1-3]孔雀、麻鸡、珠鸡等珍禽均有大肠杆菌病发生,且发病率达50%以上。对于禽大肠杆菌病多采用药物治疗,常用抗菌药的滥用,大肠杆菌对多数抗菌药的耐药性越来越强,临床上对大肠杆菌病的防治越来越困难。本试验以南京红山森林动物园珍禽繁殖场为研究对象,调查不同的珍禽大肠杆菌菌含量变化规律,分离致病性大肠杆菌,通过药敏试验,选用合理有效的抗生素,为动物园内珍禽的疾病预防和保健措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物园珍禽繁殖场情况 南京红山森林动物园珍禽繁殖场,在动物园内小红山脚下,远离动物展区500 m以上,饲养孔雀等十几种珍禽。禽舍分南北和东西两种走向,每个禽舍内面积约5～8 m2,有运动场,每间禽舍饲养的数量在4～30只不等,每天清扫3次,每周消毒1次(遇到下雨延期)。

试验于2010年1月,选择蓝孔雀、原鸡、白鹇、绿孔雀、白孔雀、麻鸡、白冠长尾雉、戴冕鹤、红腹锦鸡等9种珍禽舍进行空气样本和直肠粪便。

1.2 试验材料

1.2.1 主要试剂 营养琼脂(NA)、伊红美蓝琼脂(EMB),购于国药集团化学试剂有限公司;麦康凯琼脂(MAC)、沙门菌、志贺氏菌属琼脂(S.S.)、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管和药敏质控菌株大肠杆菌ATCC25922,均购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2.2 药敏纸片 共 20种,包括头孢菌素类6种：头孢噻吩(CEF)、头孢哌酮(CFP)、头孢吡肟(CPM)、头孢他啶(CAZ)、头孢唑啉(CFZ)、头孢三嗪(CTR);氨基糖苷类5种：链霉素(STR)、卡那霉素(KAN)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、妥布霉素(TOB);氟喹诺酮类3种：氟罗沙星(FLX)、环丙沙星(CIP)、诺氟沙星(NOR);青霉素类3种：氧呱嗪青霉素(PIP)、羧苄青霉素(BAR)、氨苄青霉素(AMP);磺胺类：复方新诺明(SXT);四环素类：四环素(TET);硝基呋喃类：呋喃妥因(AHD),购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2.3 试验动物 普通级小鼠体重18～22 g、普通级家兔,均购于南京盛民科研实验动物场。

1.3 试验方法

1.3.1 环境空气和珍禽体内样本采集 参照中华人民共和国国家标准公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定中的自然沉降法[4]采集空气样本。在每间禽舍取中央(编号为1)和运动场(编号为2)2个点,3种培养基,计6个平皿,9间禽舍,共计54个平皿。琼脂平板于离地高度为1.2 m,打开平皿盖暴露空气中10 min,然后将平皿置37℃恒温温箱中培养24 h。

用无菌棉签从蓝孔雀等9种的泄殖腔拭子涂于MAC、S.S.等培养基上。

1.3.2 大肠杆菌分离鉴定 分别取MAC、S.S.等培养基上典型红色菌落,涂片,革兰染色,镜检,初步区分革兰阳性和阴性菌,然后做肠杆菌科细菌生化鉴定,并转接种于伊红美蓝和三糖铁琼脂培养基,观察反应结果,确认大肠杆菌。

1.3.3 致病性试验 将上述生化反应已鉴定为大肠杆菌的菌株接种于普通肉汤,37℃培养18 h。取肉汤培养物分别腹腔注射小鼠,每株做3个重复。对照组小鼠腹腔注射灭菌生理盐水0.5 mL/只。观察小鼠的活动及发病死亡情况,对发病死亡小鼠立即进行剖检,观察病变,取其病料涂片,染色,镜检,并接种于MAC培养基分离培养。未发病的继续观察至1周。

1.3.4 药敏试验 采用WHO推荐的Kirby-Bauer法[5]。依据NCCLS有关标准,每次测定均以质控菌为对照,只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株结果才有效。判定标准参照美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)M100-S15[6]和文献[7],以敏感、中介、耐药3种形式对抑菌圈大小作出判定。

2 结果

2.1 菌株分离与鉴定 从采集的样本中分离到6种肠杆菌科细菌,共69个菌株,其中大肠杆菌27株占分离菌的39.13%(27/69),9种珍禽舍内和体内均分离到大肠杆菌,达100%的分离率,说明大肠杆菌在珍禽舍环境中和体内普遍存在。结果见表1。

分离到了27株大肠杆菌,在伊红美蓝琼脂上均形成黑色、带金属光泽的菌落,均为革兰阴性、两端钝圆的小杆菌、单在或成对存在。各菌均可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇,产酸产气;少数菌株发酵蔗糖,只产酸或产酸并产气;M.R.试验阳性;V-P试验阴性;产生靛基质;尿素酶试验阴性;硝酸盐还原试验阳性;吲哚试验阳性;枸橼酸盐利用试验阴性;三糖铁斜面、底层产酸变黄,有气体,无变黑现象。

表1 珍禽环境空气中的肠杆菌科菌数 (株)

2.2 动物致病性试验 27株大肠杆菌接种小鼠后,24 h内有14株接种的42只小鼠精神委靡,腹泻,饮水增加,有水样粪便后死亡;有8株接种的24只小鼠,接种后出现不同程度的精神沉郁、拉稀等临床症状,72 h内有16只死亡,其余的8只48 h后渐渐开始恢复,至72 h时基本已恢复至健康状态;其余健活。剖检死亡小鼠均见内脏充血,肝脏肿大,有出血点和坏死点;肠严重臌气,肠管变薄,心包淤血,肺出血,脾脏淤血。从死亡小鼠的心血和肝脏中均分离出大肠杆菌。由此可见,27株大肠杆菌有14株致病性较强,8株有致病性,5株无致病性。

2.3 耐药性监测 选择20种抗菌药物对9种珍禽舍环境中和珍禽体内的18株大肠杆菌进行药敏试验,20种抗菌药物中抑菌作用最强的为CEF、TOB、STR和AHD,敏感菌株占(17/18)94.44%;其次为 CFP、KAN、AMK(16/18),(88.89%);CPM(14/18)(77.78%);CTR、GEN(13/18),(72.22%)。18株大肠杆菌对抗菌药物均表现出不同程度的耐药性,耐药菌株分别占BAR(18/18),(100%);NOR(16/18),(88.89%);PIP、AMP(15/18),(83.33%);CIP、TET(14/18),(77.78%);FLX(9/18),(50%)。结果见表2和表3。

表2 18株大肠杆菌药敏试验结果 (mm)

2.4 大肠杆菌的耐药性和耐药类型 18株受试大肠杆菌均对20种抗菌药物有多重耐药性,表现对4种或4种以上药物耐药。7耐菌株所占比例最大,为22.22%(4/18);其次是5耐和9耐均为16.67%。多重耐药现象严重,最少为4种,最多为12种。最普遍的耐药类型是BAR-AMP-TET-CIP-NOR-PIPFLX,其次为 BAR-AMP-TET-SXT-CIP-NOR-PIPFLX。见表4。

表3 20种抗菌药物对18株大肠杆菌耐药性监测试验结果

表4 18株大肠杆菌耐药谱型

3 小结与讨论

3.1 动物园繁殖场饲养的各种珍禽数量虽然少,但是种类多,饲养环境同其他畜牧场所相似,都属于集约化养殖,据动物园病例记载,在珍禽中常有大肠杆菌病发生。本试验从9间珍禽舍的环境空气中和9种珍禽体内分离到大肠杆菌27株,其中14株致病性较强,致病率占58.33%,说明动物园繁殖场珍禽舍已受到致病性大肠杆菌的污染,平时应注意监测,做好消毒工作。

3.2 NCCLS早在1993年就颁布了由世界卫生组织认可的纸片扩散法药敏试验法规,其采用耐药(R)、中介(I)、敏感(S)三级报告,且为一菌一药一判断界值。本次对18株大肠杆菌耐药性监测的试验结果是参照NCCLS法规颁布的标准进行。从药敏试验结果可以看出,大肠杆菌敏感率达70%以上的主要药物有头孢噻吩、头孢哌酮、头孢吡肟、头孢三嗪、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、呋喃妥因等。其中头孢噻吩、链霉素、妥布霉素、呋喃妥因等敏感率达94.44%,此结果对于动物园珍禽繁殖场有效防治大肠杆菌病具有一定的参考价值。

3.3 大肠杆菌作为肠道常在菌,在条件变差及其他病原感染后易继发致病,并且其血清型众多、抗原复杂、容易形成耐药性,在实际生产中疫苗预防和药物防治效果不理想。目前我国畜禽大肠杆菌耐药性严重而复杂,对大多数抗菌药物都已经产生了耐药性[8]。试验的18株大肠杆菌都为多重耐药菌株,耐药性最少的菌株耐4种抗菌药物,耐药性最多的菌株耐12种,其中以7种耐药最多。通过18株大肠杆菌对20种抗菌药物的耐药类型观察发现,对氟喹诺酮类耐药的大肠杆菌,同时对青霉素类、四环素等抗菌药的耐药率在70%以上。说明受试菌不仅对同一类抗菌药中数种抗菌药物存在交叉耐药,而且对不同类抗菌药物存在严重的多重耐药。这与田勇等[9]报道的相符。多重耐药现象的存在,给珍禽大肠杆菌病的药物防治提出了新的课题。因此,在临床治疗过程中,首先要进行药敏试验,可以选择几种比较敏感的药物合用或交替使用,以减少单一药物的使用剂量或使用时间,减少耐药菌株的产生。

3.4 本次试验显示,细菌的耐药性不仅出现在规模化养殖的家畜家禽中间,在野生禽类中也已经出现明显的耐药现象,值得广大科研工作者的关注。分离的27株大肠杆菌血清型是否相同?是否有同源性?有待于进一步研究。

[1] 陈忠.麻鸡变形杆菌合并大肠杆菌感染的诊断和防治[J].养禽与禽病防治,2002,7：33-34.

[2] 陈茂发,杨珊,林淑贞,等.孔雀非典型新城疫和大肠杆菌混合感染的诊治[J].广东畜牧兽医科技,2002,27(2)：37-38.

[3] 吴建忠,李伯锵,刘容珍.珍珠鸡大肠杆菌敏感性药物帅选研究[J].中国畜牧兽医,2009,36(10)：151-152.

[4] GB/T18204.1-2000.公共场所空气微生物检验方法,细菌总数测定[S].

[5] National Committee for Clinical Laboratory Standards.Perform ance st andards for antimicrobial su sceptibility testing[M].Penns y lvania：NCCLS,2001：1-23.

[6] 李刚,文英,铁生虎,等,规模化猪场仔猪致病性大肠埃希菌的耐药性检测[J].动物医学进展,2010,31(8)：117-121.

[7] Khan A,Dass C,Ramamurthy T,et al.Antibiotic resistance,virulence gene,and molecular p rofiles of Shiga toxin producing Escherichiacoli isolatesf rom diverse sourcesin calcutta[J].J Clin Microbiol,2002,40(6)：2009-2015.

[8] 薛原,张秀英,陈建飞,等.猪源大肠杆菌多重耐药性的检测与分析[J].中国兽医杂志,2010,46(3)：41-43.

[9] 田勇,郑雪花,张建军,等.鸡源大肠埃希氏菌多药耐药性的检测与分析[J].中国兽医杂志,2008,44(1)：18-21.