心理应激对大鼠实验性牙周炎及牙周组织中低氧诱导因子1α表达的影响*

张增方， 吕芳丽， 陈 莹， 杨晓燕， 黄绮凌， 李东健， 黄世光△

(1 暨南大学医学院口腔医学系, 广东 广州 510632；2 中山大学中山医学院寄生虫学教研室， 中山大学热带病防治研究教育部重点实验室， 广东 广州 510080；3 广州市妇女儿童医疗中心口腔科， 广东 广州 510120；4 广州市荔湾区口腔医院, 广东 广州 510170)

心理应激对大鼠实验性牙周炎及牙周组织中低氧诱导因子1α表达的影响*

张增方1,3， 吕芳丽2， 陈 莹2， 杨晓燕2， 黄绮凌1， 李东健4， 黄世光1△

(1暨南大学医学院口腔医学系, 广东 广州 510632；2中山大学中山医学院寄生虫学教研室， 中山大学热带病防治研究教育部重点实验室， 广东 广州 510080；3广州市妇女儿童医疗中心口腔科， 广东 广州 510120；4广州市荔湾区口腔医院, 广东 广州 510170)

目的探讨心理应激对牙周炎及其氧代谢的影响。方法建立大鼠实验性牙周炎模型并予以应激刺激，SPF级4 周龄雄性Wistar大鼠48只，随机分为4组：(1)正常对照组；(2)实验性牙周炎组：用浸有牙周致病菌的丝线结扎左侧上颌第二磨牙牙颈部复制牙周炎模型；(3)单纯应激组：牙周不作特殊处理，给予应激刺激；(4)牙周炎+应激组：按上法复制牙周炎模型，并予以应激刺激。各组动物分别于实验后第1、4、6、8 周末分批处死，各时点每组处死的动物数为3只。大鼠处死前测量牙周附着丧失, 制作牙体牙周联合切片观察牙周的组织学改变；采用免疫组化法检测各实验组大鼠牙周组织低氧诱导因子 1α(HIF-1α)的表达水平，通过计算HIF-1α平均阳性细胞率来评估组织的缺氧程度。结果(1)与正常对照组比较，单纯应激组牙周附着丧失程度在各时点均无显著差异(P>0.05)；(2)牙周炎+应激组牙周附着丧失程度在4、6和8周时明显高于牙周炎组(P<0.01)；(3)与正常对照组比较，单纯应激组HIF-1α平均阳性细胞率在各时点均无显著差异(P>0.05)；(4)牙周炎+应激组HIF-1α平均阳性细胞率在4、6和8周时显著高于牙周炎组(P<0.01)。结论应激刺激可能通过降低牙周组织氧代谢水平加重大鼠牙周炎症程度。

牙周炎； 动物模型； 心理应激； 低氧诱导因子1α

心理应激与牙周健康状况密切相关，可能是牙周炎的重要危险因素之一[1,2]。 目前关于心理应激影响牙周炎机制的研究多集中在免疫及内分泌等方面，其确切机制至今仍未阐明。有关心理应激影响牙周组织氧代谢的机制，国内外的研究较少涉及。氧代谢对牙周组织生理机能的维持起着非常重要的作用，牙周组织氧代谢变化对牙周炎症发展可能起重要影响。低氧诱导因子 1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)是细胞低氧适应与应答调节的关键因子[3,4]，HIF-1α在缺氧诱导下表达增强，通过检测HIF-1α蛋白在组织局部的表达情况可判断组织的氧代谢情况。本文利用大鼠实验性牙周炎的模型，观察心理应激对牙周炎及牙周组织中HIF-1α表达的影响，以了解应激对牙周炎及其氧代谢的影响情况。

材 料 和 方 法

1材料

SPF级Wistar大鼠购自中山大学医学院实验动物中心；大鼠HIF-1α的Ⅰ抗及Ⅱ抗免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

2方法

2.1实验动物分组 SPF级4周龄雄性Wistar大鼠48只，体重约170-200 g，经适应性饲养1周后实验。大鼠按随机数字表法分成4组，每组12只：(1) 正常对照组(control group)：动物正常喂养，牙周不作特殊处理；(2)实验性牙周炎组(experimental periodontitis group)：用浸有牙周致病菌的3-0丝线结扎左侧上颌第二磨牙牙颈部复制牙周炎模型；(3)单纯应激组(stress group)：牙周不作特殊处理，给予应激刺激；(4)牙周炎+应激组(periodontitis with stress group)：按上法复制牙周炎模型，并予以应激刺激。各组动物分别于实验后第1、4、6、8 周末分批处死，各时点每组处死动物数为3只。

2.2牙周致病菌丝线的制备 收集临床确诊为慢性牙周炎患者的牙周病变区域龈下菌斑，置于盛有1.0 mL硫乙醇酸盐溶液的小瓶中，充分混匀，以生理盐水进行10倍系列稀释，选择稀释度为10-3的浓度接种于CDC厌氧血琼脂平板上，将3-0无菌丝线置于该琼脂平板上，在厌养菌培养箱中37 ℃培养5 d。

2.3牙周炎动物模型的建立 采用0.3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠，大鼠按每10 g体重注射麻药0.1 mL。待动物麻醉失去知觉后，使之仰卧位，固定四肢及头部，1%碘酊消毒口腔及口周，用70%乙醇脱碘，并以棉线牵拉固定上、下颌，使之呈大张口状，丝线穿舌全层拉向一侧。用尖探针分离左侧上颌第2磨牙牙龈组织，用浸有牙周致病菌的3-0丝线缠绕牙颈部1圈，结扎丝线置于龈沟内，于近中颊处打结。实验后1周内每天检查结扎丝线，若结扎丝线出现松脱则及时重新结扎。

2.4应激方案 采取3种应激方案：(1)限制性应激：将大鼠置于空间局限的小铁笼中，限制其活动及饮食5 h；(2)冷水浸泡应激：将大鼠置于空间局限的小铁笼中，并用冷水浸至大鼠锁骨以上位置，浸泡2 h；(3)猫惊吓应激：选择发情期雌猫，叫声刺耳，躁急，好动；将鼠笼置入猫笼中12 h，期间大鼠处于恐惧应激状态。实验开始后，每天随机选择此3种应激方案中的1种加于应激组大鼠。

2.5观察指标及检测方法 (1)牙周附着丧失的测量：采用0.3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠，待其进入麻醉状态后，取仰卧位，固定头部及四肢，选用自制牙周探针探测牙周附着丧失数值，牙周探针的刻度单位与工作端直径均为0.2 mm。牙周附着丧失为釉牙骨质界到牙周袋底的距离，测量部位为实验牙颊、腭侧近中、中央、远中共6个点，取平均值。(2)大体标本及组织学观察：采用颈椎脱臼法处死大鼠，取上颌骨标本于10%中性甲醛液中固定48 h以上，修整标本，仅保留磨牙区段牙齿及牙周组织。采用混合脱钙液脱钙，制成颊舌向5 μm厚度的牙体牙周组织联合切片，HE染色，光学显微镜下观察牙周组织的组织学改变。(3) HIF-1α免疫组织化学SABC法染色及结果处理：Ⅰ抗HIF-1α稀释浓度为1∶50，DAB显色液显色。阴性对照采用PBS缓冲液代替Ⅰ抗，苏木素轻度复染。免疫组化阳性信号为棕黄色细小颗粒，定位于细胞核或细胞浆。对每个标本切片中阳性细胞进行记数。每个切片记数5个200倍视野下总细胞数及阳性细胞数，计算阳性细胞率(%)，即阳性细胞数占总细胞数的比例，取其平均值，为该标本切片的平均阳性细胞率。

3统计学处理

结 果

1牙周附着丧失(attachmentloss，AL)

各实验组和正常对照组大鼠牙周AL见表1。(1)牙周炎组和牙周炎+应激组AL在各个时点明显高于正常对照组和单纯应激组(P<0.01)；(2)单纯应激组AL在各时点与正常对照组比较均无显著差异(P>0.05)；(3)牙周炎+应激组AL在4、6和8周时明显高于牙周炎组(P<0.01)。

表1 各实验组和对照组大鼠牙周附着丧失的变化

2大体标本及组织学改变

正常对照组及单纯应激组牙龈完整，牙周附着位置正常,见图1A、C。实验性牙周炎组第4 周时可见轻度牙龈萎缩，探及浅牙周袋，尚无明显附着丧失；第6周时出现牙龈萎缩，附着丧失明显，见图1B；第8周时牙龈萎缩，附着丧失明显加重。牙周炎+应激组第4 周时大体标本出现轻度牙龈萎缩，探及牙周袋，有附着丧失；第6周时牙龈萎缩，附着丧失严重，见图1D；第8周时牙龈萎缩，附着丧失明显加重，根分叉暴露，累及两侧邻牙。

Figure 1. Samples 6 weeks after ligature.A: normal control group; B: experimental periodontitis group，moderate periodontal pocket was shown; C: stress group, normal sign of periodontium was shown; D: periodontitis with stress group, severe periodontal pocket was shown.

3HIF-1α免疫组化染色结果

HIF-1α免疫组化阳性信号为棕黄色细小颗粒，位于细胞核或细胞浆内。正常对照组牙周组织未见阳性细胞，见图2A；牙周炎组，牙周组织见较多的HIF-1α阳性细胞，见图2B；单纯应激组，牙周结缔组织中见少量弱阳性细胞，上皮细胞未见阳性细胞，见图2C；牙周炎+应激组牙周组织见大量HIF-1α阳性细胞，见图2D，且牙周炎+应激组HIF-1α阳性表达明显多于牙周炎组。

各实验组平均阳性细胞率见表2，结果表明：(1)正常对照组平均阳性细胞率在各时点与单纯应激组比较均无显著差异(P>0.05)；(2)牙周炎组和牙周炎+应激组平均阳性细胞率在各个时点明显高于正常对照组和单纯应激组(P<0.01)；(3)与牙周炎组比较，除了在1周时牙周炎+应激组平均阳性细胞率与牙周炎组间无明显差异(P>0.05)，其余各个时点牙周炎+应激组平均阳性细胞率明显高于牙周炎组(P<0.01)；(5)牙周炎组和牙周炎+应激组在6和8周时平均阳性细胞率明显高于1和4周(P<0.01)。

讨 论

1心理应激是牙周炎的重要危险因子

牙周炎发病机制复杂，牙周微生物是牙周病必需的始动因素，但单纯的细菌因素不足以解释疾病的复杂性和严重性。研究表明宿主反应在牙周病发生、发展中起重要作用。心理应激是机体对精神压力或刺激的心理和生理的反应。研究显示心理应激和急性坏死溃疡性牙龈炎有关。大量的人群调查显示牙周炎与心理应激有明显的相关性[5]。近期的研究认为心理应激与牙周健康状况密切相关，是牙周炎的重要危险因子之一[6，7]。

表2 各实验组和对照组HIF-1α表达的平均阳性细胞率

心理应激影响牙周病的机制至今仍未阐明，多数学者认为各种社会、心理因素以应激为中介，通过神经-内分泌-免疫系统之间的相互作用、相互影响，导致免疫功能低下和内分泌失衡，诱发疾病，如心理应激可增加糖皮质激素的释放，抑制炎症及免疫反应，从而降低宿主防御系统的功能。

在本实验中，我们对大鼠采用限制性应激刺激、冷水浸泡应激刺激和猫惊吓应激刺激3种应激刺激方案，每天随机选择其中1种方案对实验动物进行刺激，以模拟现实社会中应激源的多样性、不确定性，防止了实验动物对应激源的适应。在我们的动物实验中观察到牙周炎+应激组牙周附着丧失明显高于牙周炎组，组织学也观察到牙周炎+应激组牙周组织的炎症程度较牙周炎组更严重。我们的实验结果表明单纯的应激刺激对大鼠正常牙周组织没有明显影响，但心理应激可以加重牙周炎模型的炎症程度。Takada等[8]的实验结果表明限制性应激可加重大鼠牙周炎模型的炎症进程。Peruzzo等[9]的研究结果表明慢性心理应激通过使局部前炎症因子和前骨吸收因子的增加，明显加重了结扎诱导牙周炎的骨吸收。李博等[10]的研究结果显示应激可加重牙周组织炎症的破坏程度，是牙周炎的重要危险因素。

2心理应激可能通过降低牙周组织氧代谢加重牙周炎

心理应激是牙周炎的重要危险因子之一，有关心理应激影响牙周组织氧代谢的机制国内外的研究较少涉及。氧对于细胞代谢活动及生存是必需的，在缺氧状态下，细胞许多基因的转录、表达发生变化，对缺氧作出应激反应，导致代谢紊乱、功能失调和出现各种各样的病理生理变化。组织的氧代谢情况可以通过检测HIF-1α蛋白表达情况来反映。HIF-1是由α、β 2个亚基组成的碱性螺旋环螺旋超家族成员，其中HIF-1β能较容易地在所有细胞中发现，而HIF-1α在正常氧态下不易检测到，是细胞低氧适应与应答调节的关键因子，低氧可通过抑制酶对HIF-1α的快速泛素化和降解来提高HIF-1α蛋白的水平。炎症组织局部的缺氧环境可诱导HIF-1α蛋白含量迅速上升，使其表达增强。通过检测HIF-1α蛋白在组织局部的表达情况可反映组织的氧代谢情况。

在我们的实验中，通过检测各实验组在各时点牙周组织内HIF-1α蛋白阳性表达情况来判断组织内的氧代谢情况，并通过计算HIF-1α平均阳性细胞率来评估组织的缺氧程度。结果表明牙周组织在炎症状态下，氧代谢降低，单纯的应激刺激本身不会明显影响正常牙周组织氧代谢，但应激刺激可以明显降低已经存在炎症的牙周组织的氧代谢，使牙周组织低氧状况加重，从而加重牙周炎。Manhold等[11]的研究结果也表明长期或持续的情绪化状态，可以刺激植物神经系统，使牙周组织毛细血管长时间处于收缩状态，影响牙龈微循环，导致氧和营养物质的供应量减少；他们还发现应激状态下的大鼠牙周组织利用氧的能力也会降低。

另外，作为检测组织是否缺氧的指标，HIF-1α不仅与缺氧有关，其本身也是重要的炎症因子，低氧状态下HIF-1α释放增多也可能对炎症产生作用。Cramer等[12]证实在髓样细胞HIF-1基因缺陷的炎症模型中，与HIF-1基因无缺陷的炎症模型相比，炎症渗出基本消失，提示HIF-1α具有调节炎症区微环境的的作用。Hellwig-Bürgel等[13]的研究表明HIF-1α可能参与调节调节炎症反应过程中涉及的基因表达。Albina等[14]证实HIF-1α等能以非低氧诱导的形式诱导伤口愈合初期炎症细胞HIF-1α产生。夏红利等[15]的研究显示HIF-1α在急性胰腺炎的发病机制中起促进炎症发展的作用。刘金波等[16]的研究表明在牙髓炎发生时，缺血、缺氧环境诱导HIF-1α的产生，炎症因子如IL-1和TNF-α等可激活 HIF-1α，从而使得 HIF-1α在上游水平调控iNOS、VEGF启动修复机制成为可能，据此推测 HIF-1α作为一个调控因素，对炎症的进程起调节作用。An等[17]的研究还表明HIF-1α与缺氧环境中细胞凋亡有关。因此，HIF-1α表达增强除了表明组织氧代谢降低外，HIF-1α还可能参与炎症进程的调节，与炎症发展有着多方面的联系。

我们的结果表明心理应激可能通过降低牙周组织局部的氧代谢水平，使局部组织处于缺氧状态，起到加重牙周炎症的作用。低氧状态下，HIF-1α的释放增多可能还直接参与调节牙周病的炎症进程。在牙周炎的治疗方案中，可以考虑通过纠正牙周局部低氧状态，提高牙周局部供氧量，缓解组织缺氧，减少牙周组织的破坏，为处于应激状态下的牙周炎患者提供更加合理有效的治疗方案。在制定牙周炎治疗计划时应对患者的心理状态予以评估和重视，以期制定更个体化、更高效的治疗方案。

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Effectofpsychologicalstressondevelopmentofperiodontitisandexpressionofperiodontalhypoxia-induciblefactor1αinrats

ZHANG Zeng-fang1,3, LÜ Fang-li2, CHEN Ying2, YANG Xiao-yan2, HUANG Qi-ling1, LI Dong-jian4, HUANG Shi-guang1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.2DepartmentofParasitology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,KeyLaboratoryofTropicalDiseaseControl(SunYat-senUniversity),MinistryofEducation,Guangzhou510080,China;3DepartmentofStomatology,GuangzhouWomenandChildren’sMedicalCenter,Guangzhou510120,China;4StomatologicalHospitalofLiwanDistrict,Guangzhou510170,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To investigate the effect of psychological stress on the development of periodontitis and the expression of periodontal hypoxia-inducible factor 1α(HIF-1α) in rats.METHODSForty-eight male Wistar rats(SPF grade) were randomly divided into 4 groups:(1) normal control group, i.e. naive rats;(2) experimental periodontitis group: the periodontitis model was induced by wrapping 3-0 silk ligature inoculated with putative periodontopathic bacteria around the left maxillary second molar of the rats;(3) stress group: the rats were treated with stress alone;(4) periodontits with stress group, the periodontitis model was induced as above,and the rats were treated with stress. The rats were sacrificed at week 1, 4, 6 and 8 after the ligature. The attachment losses(AL) were measured by home-made probe. The histological changes of periodontal tissues stained with hematoxylin and eosin(HE) were observed under microscope. The HIF-1α expression level in the periodontal epithelium was determined by immunohistochemistry that was used to evaluate the severity of hypoxia by measuring the average rate of HIF-1α-positive cells.RESULTSNo significant difference of AL between stress group and normal control group was observed(P>0.05).The AL and the average rate of HIF-1α-positive cells in periodontitis with stress group were significantly higher than those in experimental periodontitis group at time points of week 4,6 and 8 after ligature(bothP<0.01).CONCLUSIONPsychological stress is one of the periodontitis inducing factors in the animal model. Psychological stress may aggravate periodontitis by decreasing tissue oxygenation in rats.

Periodontitis; Models,animal; Psychological stress; Hypoxia-inducible factor 1α

R78

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-020

1000-4718(2011)02-0315-05

2010-09-26

2010-10-28

国家自然科学基金资助项目(No.81071387);广东省自然科学基金资助项目(No.10151008901000006)△通讯作者 Tel:020-85221165; E-mail: thshg@126.com