胰岛素瘤抑癌基因p27的表达及其与CpG岛甲基化表型的关系

周乔 肖雨 朱丽明 向红丁 陈元方 陈原稼

·论著·

胰岛素瘤抑癌基因p27的表达及其与CpG岛甲基化表型的关系

周乔 肖雨 朱丽明 向红丁 陈元方 陈原稼

目的探讨胰岛素瘤抑癌基因p27的表达及其与CpG岛甲基化表型(CpG island methylation phenotype, CIMP)间的关系。方法用免疫组化方法检测27例胰岛素瘤组织及11例瘤旁正常胰腺组织中p27的表达。用甲基化特异性PCR (MSP) 方法检测这些组织中p16、MLH1、RAR-β、MGMT、THBS1基因的甲基化状态。分析p27表达、CIMP与临床病理参数间的相关性。结果胰岛素瘤组织p27蛋白表达阳性率较瘤旁胰腺组织显著降低(48%比91%，P=0.008)。胰岛素瘤组织的高CIMP发生率为33%(9/27)，瘤旁正常胰腺组织的高CIMP发生率为18%(2/11)，肿瘤组织为正常胰腺组织的2倍,但差异无统计学意义(P=0.350)。胰岛素瘤的MGMT甲基化与p16的甲基化呈显著负相关(P=0.004)，胰岛素瘤的p27表达与高CIMP呈负相关的趋势,但差异无统计学意义(P=0.420)；p27的表达和CIMP的发生与胰岛素瘤的临床病理参数均无显著相关性。结论胰岛素瘤p27表达下调，并存在高CIMP,提示p27的失活和多基因的表观遗传学异常在该肿瘤的发生过程中可能起一定作用。

胰腺内分泌肿瘤; 胰岛素瘤; 抑癌基因p27; CIMP; 甲基化

胰岛素瘤是胰腺内分泌肿瘤中最常见的一种。我们以往的研究发现[1]，部分散发性胰岛素瘤和MEN-1基因失活有关。近期的研究又发现胰岛素瘤中错配修复基因异常,特别是MLH1基因发生高甲基化[2-3]。文献报道[4]，在小鼠MEN1突变所导致的胰岛素瘤中,p27的表达下降。因此，本实验观察人胰岛素瘤p27的表达，分析其与CpG岛甲基化表型(CpG island methylation phenotype, CIMP)的相关性，以探寻该肿瘤发生的分子机制。

材料与方法

一、标本来源及诊断标准

收集1992年至2008年北京协和医院手术切除经病理证实的27例胰岛素瘤标本，以11例瘤旁胰腺组织作为对照。 胰岛素瘤的诊断标准参照我们已往发表的文章[3, 5-6]。

二、p27表达的检测

采用小鼠二步法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物试剂有限公司)检测p27蛋白表达。小鼠抗人p27单抗(BD公司)1∶100稀释。结果判断标准按照我们以往研究[2-3]：细胞核有棕黄着色者为阳性细胞。阳性细胞占总细胞数的百分值>20%为表达阳性。

三、p16、MLH1、RAR-β、MGMT、THBS1的CIMP的测定

按我们以往的方法[3]从冷冻组织和石蜡组织标本中提取基因DNA，并行甲基化修饰。各基因启动子的PCR引物序列见表1。采用甲基化特异性PCR(MSP)及非甲基化特异性PCR(USP)法检测基因CpG岛的甲基化状态。结果判定：肿瘤组织中有4～5个基因出现甲基化为高CIMP； 0～3个基因出现甲基化为低CIMP。

四、统计学分析

用SPSS 16.0统计软件进行分析,率的比较采用Fisher精确检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、一般临床资料

27例胰岛素瘤患者中男性8例，女性19例，年龄16～74岁，平均(48±3)岁。术前血清胰岛素水平为(58.1±9.2)mU/L，中位数49.7mU/L；术前血糖水平为(2.8±0.2)mmol/L，中位数2.5 mmol/L。胰岛素瘤位于胰头颈部16例(59%)，胰体尾部11例(41%)。瘤体最大径≥2 cm者12例(44%),<2 cm 15例(56%)。经病理证实，21例(78%)为良性,6例(22%)为恶性。

二、p27蛋白表达

p27蛋白位于肿瘤细胞的胞核(图1)，肿瘤组织p27阳性表达率为48%(13/27)；瘤旁正常组织中，p27蛋白主要位于胰岛内,导管上皮和腺泡细胞表达较少，阳性表达率为91%(10/11)。胰岛素瘤p27蛋白表达率明显低于瘤旁正常胰腺组织(P=0.008)。

表1 各基因启动子的PCR引物序列

注： RKO为结肠癌细胞系，803为胃癌细胞系，PA-1为人神经母细胞瘤细胞系

图1胰岛素瘤旁胰腺组织和瘤组织的病理变化(a、c；HE ×200)和p27蛋白表达(b、d；免疫组化染色 ×200)

三、胰岛素瘤组织CIMP的状况

部分组织的CpG岛甲基化测定结果如图2所示。27例肿瘤组织中,p16的甲基化比例为33%(9/27)，MLH1为81%(22/27)，RAR-β为96%(26/27)，MGMT为81%(22/27)，THBS1为30%(8/27)；高CIMP发生率为33%(9/27)。11例瘤旁正常胰腺组织中高CIMP发生率为18%(2/11)。肿瘤组织高CIMP发生率为对照胰腺组织的2倍,但由于例数较少,统计学分析无显著差异(P=0.350)。在发生p16甲基化的9例胰岛素瘤组织中有4例(44%)同时存在MGMT甲基化,而未发生p16甲基化的18例肿瘤中均发生了MGMT甲基化,二者之间存在显著负相关(P=0.004)。

M：甲基化条带，U：无甲基化条带

图2胰岛素瘤组织p16(a)、MLH1(b)的MSP及USP扩增结果

四、CIMP与p27表达的相关分析

14例p27表达丢失或下降的肿瘤中有6例(43%)发生高CIMP,而13例p27表达正常的肿瘤中仅3例(23%)发生高CIMP，p27表达与高CIMP呈负相关的趋势,但差异无统计学意义(P=0.420)。

五、CIMP与临床病理参数的相关性

CIMP的高低与患者性别、年龄、术前胰岛素水平、术前空腹血糖水平、肿瘤部位、肿瘤大小、良恶性及疗效均不相关(表2)。单独将每个基因的甲基化与临床病理资料进行分析,发现MGMT的甲基化与肿瘤部位具有相关性(P=0.047),显示原发部位在胰头的胰岛素瘤更易发生MGMT甲基化,而MGMT非甲基化的肿瘤多位于胰体尾。

表2 CIMP与胰岛素瘤临床病理参数的关系

六、肿瘤组织p27表达与临床病理参数的相关性

胰岛素瘤组织p27表达与患者性别、年龄、术前胰岛素水平、空腹血糖水平、肿瘤部位、肿瘤大小、良恶性及预后均不相关(表3)。

表3 肿瘤组织p27表达与临床病理参数的关系

讨 论

胰岛素瘤是最常见的胰腺内分泌肿瘤之一,其发生的分子病理学机制目前仍不明确,并且临床上缺乏有效的诊断及鉴别良恶性的分子标记物。 文献报道在结直肠癌[7]、乳腺癌[8]、胰腺癌[9]等多种肿瘤中观察到了CIMP现象。CIMP现象可能在肿瘤的筛查、诊断、高危人群评估、制定最适治疗方案中起作用[10]。p27属于细胞周期调控蛋白，其表达水平在乳腺癌、结肠癌、前列腺腺癌等多种肿瘤亦有所下降,在结肠癌中,p27与高CIMP存在显著相关性[7]。本实验检测胰岛素瘤p27蛋白表达, 结果提示p27在胰岛素瘤的表达降低，与文献结果一致。

文献报道[11-13]，甲基化、磷酸化或经泛素途径的降解增加等可能是p27表达下降的原因。我们根据本实验室以往的研究结果及文献报道挑选了p16、MLH1、RAR-β、MGMT和THBS1等5个基因作为本实验的一组CIMP标记基因。 通过对27个胰岛素瘤标本和11个瘤旁正常胰腺组织这5个基因的甲基化测定,显示肿瘤组织中高CIMP发生率高于正常胰腺组织, 但无统计学差异。 其原因可能是：(1)样本量较小；(2)瘤旁组织中有3个出现高CIMP现象,提示部分瘤旁正常组织已经发生了分子的改变；(3)对高CIMP的定义不同。文献以2个或2个以上基因出现甲基化定义为高CIMP[14],而我们以4个及4个以上 (≥4/5) 出现甲基化定义为高CIMP。

文献报道[15]，肿瘤中MGMT的甲基化往往与其他抑癌基因,如p21、p16和MLH1的甲基化呈正相关。本研究通过对这5个基因CIMP之间相互关系的分析，发现肿瘤组织p16甲基化与MGMT甲基化间存在显著负相关性。而在瘤旁正常组织中,两者无相关性。此外，通过对CIMP和p27表达的分析，发现肿瘤组织p27表达下降，高CIMP发生率增加，而在正常胰腺组织与此正好相反，提示p27的表达下降可能和高CIMP发生率增高有关,两者可能在散发型胰岛素瘤的发生中起作用,阐明其中的分子机制或有助于为散发型胰岛素瘤的诊治提供参考。

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2011-05-11)

(本文编辑：吕芳萍)

OccurrenceofCpGislandmethylationphenotypeandexpressionofp27ininsulinoma

ZHOUQiao,XIAOYu,ZHULi-ming,XIANGHong-ding,CHENYuan-fang,CHENYuan-Jia.

DepartmentofGastroenterology,PekingUnionMedicalCollegeHospital;ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100733,China

CHENYuan-jia,Email:yuanjchen@gmail.com

ObjectiveTo study the expression of p27 and its relationship with CpG island methylation phenotype (CIMP) in insulinoma.MethodsExpression of p27 was tested in 27 insulinoma tissues and 11 paired control tissues by immunohistochemistry staining. CpG island methylation of p16，MLH1，RAR-β,MGMT,THBS1(CIMP ) was detected in 27 insulinoma tissues and 11 paired control tissues by methylation specific PCR (MSP). The data of p27 and CIMP expression were correlated with the clinicopathological characteristics.ResultsThe positive expression rate of p27 in insulinoma tissues was significantly lower than that in paired control tissues (48%vs91%,P=0.008). High rate of CIMP occurrence in insulinoma tissues was 33% (9/27), while it was 18%(2/11) in paired control tissues, and difference between the two groups was not statistically significant (P=0.350). The methylation of MGMT was reversely associated with p16 methylation (P=0.004). p27 expression in insulinoma tissues was reversely associated high rate of CIMP occurrence but it was not statistically significant (P=0.420). Neither the expression of p27 nor the occurrence of CIMP was associated with the clinicopathological features.ConclusionsDown-regulation of p27 and high rate of CIMP occurred in insulinomas, suggesting that the inactivation of p27 and epigenetic alterations of several genes might contribute to the carcinogenesis of insulinoma.

Pancreatic endocrine neoplasms; Insulinoma; Tumor suppressor gene p27; CIMP; Methylation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.011

100730 北京，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院消化内科(周乔、朱丽明、陈元方、陈原稼)，内分泌科卫生部重点实验室(向红丁)，病理科(肖雨)(周乔现在四川省人民医院风湿免疫科，成都 610072)

陈原稼,Email: yuanjchen@gmail.com