急性坏死性胰腺炎大鼠肺组织水通道蛋白-1的动态变化及其意义

王锋 黄鹤光 陆逢春 陈燕昌

急性坏死性胰腺炎大鼠肺组织水通道蛋白-1的动态变化及其意义

王锋 黄鹤光 陆逢春 陈燕昌

重症急性胰腺炎(SAP)早期常并发多器官衰竭，其中以呼吸功能衰竭最多见[1]。SAP早期一旦发生急性肺损伤(ALI)，出现肺水肿、胸水，意味着患者预后很差[2-3]。本研究观察水通道蛋白1 (AQP1)在急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肺组织中的动态变化，探讨AQP1在肺水肿形成中的作用。

一、材料和方法

1．实验动物与分组：健康清洁级成年雄性和雌性SD大鼠80只，体重200～230 g，购自福建医科大学实验动物中心。适应性饲养1周后按完全随机法随机分成ANP组和假手术对照组，各40只。参考Goldenberg等[4]方法，采用胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠0.1 ml/100 g体重制备ANP模型。对照组仅翻动胰腺后关腹。术后3、6、12、24 h分批处死动物，测胸腔积液量，下腔静脉抽血及取肺、胰腺组织。

2．血清淀粉酶测定：应用全自动生化分析仪(LX20，Beckman, USA)检测。

3．肺系数测定：取右肺称湿重，然后置70℃烤箱中烤2 d至恒重，称其干重。肺系数为肺湿、干重比值(W/D)。

4．肺及胰腺组织学检测：取左上肺及完整胰腺，置10%福马林液固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色，由两位病理专业医师采用双盲法读片，并参照Thome等[5]、Schmidt等[6]标准分别给肺及胰腺病理改变评分。

5．AQP1蛋白表达检测：采用免疫荧光组织化学法和蛋白质印迹法检测。取左下肺置4%多聚甲醛+0.3%戊二醛固定液固定，常规行免疫荧光组织化学法。兔抗大鼠AQP1的IgG购自Santa cruz biotechnology公司，羊抗兔IgG-FITC购自Abcam公司。另取新鲜的肺组织，用细胞裂解液制备组织匀浆，常规行蛋白质印迹法，最后ECL 发光。

6．AQP1 mRNA表达检测：采用荧光定量PCR法检测。应用RNAisoTMPlus (TaKaRa公司)提取RNA，用逆转录试剂盒逆转录cDNA，在荧光定量PCR仪(PCR ABI 7500)上进行扩增。AQP1引物：上游5′-TCACTTGGCCGAAATGACCTG-3′，下游5′-GTCCCACCCAGAAAATCCAGT-3′(280 bp)；内参GAPDH引物： 上游5′-TCTTCCAGGAGCGAGATCCC-3′，下游5′-AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′(320 bp)。PCR反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 31 s，40个循环。

二、结果

1．大鼠血淀粉酶的变化：ANP组大鼠血清淀粉酶呈时间依赖性明显升高，峰值在12 h，对照组血淀粉酶无明显变化(表1)。

2．大鼠胸水量及肺系数变化：对照组大鼠未见胸腔积液，肺系数无明显变化；ANP3、6 h组大鼠未见胸腔积液，12 h组1只大鼠出现胸腔积液，量3 ml；24 h组3只大鼠出现胸腔积液，量3～7 ml，肺系数随时间推移逐渐增高 (表1)。

3．肺及胰腺组织病理学变化：对照组大鼠肺及胰腺组织无明显病理改变。ANP大鼠肺及胰腺组织随时间推移病理损伤逐渐加重 (图1) ，肺、胰腺组织病理评分较对照组显著升高(P值均<0.01，表1)。

4．肺组织AQP1 mRNA及蛋白表达的变化：ANP大鼠肺组织AQP1 mRNA及蛋白表达从6 h后逐渐减少。而膜表面表达大量AQP1蛋白的红细胞的数量随时间推移而增加(图2)。

组别只数时间点血清淀粉酶(U/L)肺W/D肺组织病理评分胰腺组织病理评分对照组403h834±974．5±0．20．1±0．10．1±0．26h794±884．6±0．20．1±0．10．1±0．312h831±934．6±0．20．1±0．10．2±0．324h796±934．6±0．10．1±0．10．1±0．3ANP组403h1528±290b4．9±0．23．7±0．9b4．7±0．5b6h3831±565b5．2±0．2a12．7±2．0b8．4±0．7b12h 6651±1158b5．8±0．3b22．7±1．8b13．8±0．7b24h2417±400b6．5±0．2b29．3±1．1b16．0±0．2b

注：与对照组比较，aP<0.05；bP<0.01

图1 对照组(a)及ANP 3(b)、6(c)、12(d)、24(e) h组大鼠胰腺(上)、肺(下)组织病理改变(HE ×100)

图2 对照组(a)及ANP 3(b)、6(c)、12(d)、24(e) h组大鼠肺组织AQP1表达(免疫荧光组化 ×500)

讨论水通道蛋白(aquaporin,AQP) 是一族小分子疏水性跨膜蛋白质，有极强的水通透性[7]，主要介导自由水被动跨膜转运，速度为(100～200)×10-6m/s，对平衡细胞内外环境起重要作用。AQP在胞膜中形成一个4聚体结构，中间留有孔道，孔道的直径为3.8，仅能通过一个单水分子，孔道内侧带有正电荷，能阻止带电荷的小分子通透[8]。目前发现的APQs有13种(AQP 0～12)[9-11]，在肺组织中有AQP1、3、4、5、8、9等6种AQPs表达[12]。AQP1主要在肺毛细血管内皮细胞中表达，肺泡上皮表达较少，其介导水分子的跨膜转运作用占内皮细胞膜水通透性的85%。另外，AQP1还分布于脏层胸膜上[13]，维持胸膜腔内少量润滑液的出入平衡。

AQPs在肺水肿形成过程中的作用尚无定论。通过AQPs基因敲除小鼠模型发现肺泡和毛细血管间的水通透性降低10～30倍，但对基因敲除模型ALI肺水肿和胸腔积液的形成似乎并无明显的作用[14-15]。但有学者发现ALI 后AQP1表达下降，与肺水肿形成具有相关性。本实验制备的ANP大鼠模型在早期出现明显的肺炎症渗出、水肿，甚至大量胸腔积液，表明ANP并发了ALI。结果显示，ANP大鼠肺组织AQP1 mRNA表达在3 h前短暂增加，6 h后逐渐下调，且AQP1蛋白表达也逐渐减少，而肺充血、水肿随时间推移逐渐加重，表明肺AQP1表达水平下调，严重影响了AQP1介导的水分子跨膜转运效率，导致肺泡内液清除障碍、肺间质内液体回吸收减少。因此，肺AQP1可能不是导致SAP肺水肿形成的主要原因，而是AQP1表达下调及其转运效率下降加快了SAP肺水肿形成过程，加重了肺损伤及肺水肿的严重程度，推进了ARDS的进程。

[1] Buchler MW, Gloor B, Muller CA, et al.Acute necrotizing pancreatitis: treatment strategy according to the status of infection. Ann Surg,2000,232: 619-626.

[2] Kong L, Santiago N, Han TQ, et al.Clinical characteristics and prognostic factors of severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol, 2004,10: 3336-3338.

[3] Talamini G, Uomo G, Pezzilli R, et al.Serum creatinine and chest radiographs in the early assessment of acute pancreatitis. Am J Surg,1999,177: 7-14.

[4] Goldenberg A,Romeo AC,Moreira MB,et al.Experimental model of severe acute pancreatitis in rabbits.Acta Cir Bras,2007,22: 366-371.

[5] Thome UH, Schulze A, Schnabel R, et al.Partial liquid ventilation in severely surfactant-depleted, spontaneously breathing rabbits supported by proportional assist ventilation. Crit Care Med, 2001, 29:1175-1180.

[6] Schmidt J,Rattner DW,Lewandrowski K,et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.Ann Surg,1992,215:44-56.

[7] Preston GM, Carroll TP, Guggino WB, et al. Appearance of water channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHIP28 protein. Science, 1992, 256: 385-387.

[8] Verkman AS.Applications of aquaporin inhibitors.Drug News Perspect,2001, 14: 412-420.

[9] Yang B.The human aqoaporin gene family. Current Genomics, 2000, 1: 91-102.

[10] Verkman AS.Physiological importance of aquaporin water channels. Ann Med, 2002,34: 192-200.

[11] Hatakeyama S, Yoshida Y, Tani T, et al.Cloning of a new aquaporin (AQP10) abundantly expressed in duodenum and jejunum. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 287: 814-819.

[12] Maeda S, Ito H, Tanaka K, et al. Localization of aquaporin water channels in the airway of the musk shrew (Suncus murinus) and the rat.J Vet Med Sci, 2005, 67:975-984.

[13] King LS, Agre P.Pathophysiology of the aquaporin water channels. Annu Rev Physiol, 1996, 58: 619-648.

[14] Song Y, Fukuda N, Bai C, et al.Role of aquaporins in alveolar fluid clearance in neonatal and adult lung, and in oedema formation following acute lung injury:studies in transgenic aquaporin null mice. J physiol, 2000, 525: 771-779.

[15] Verkman AS, Yang B, Song Y, et al.Role of water channels in fluid transport studied by phenotype analysis of aquaporin knockout mice. Exp Physiol, 2000, 85: 233S-241S.

2010-11-15)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.021

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