HSV-TK逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度测定

李 洋 钱 明 井宏宇 钱东华 (吉林大学第一医院呼吸内科，吉林 长春 3002)

HSV-TK逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度测定

李 洋 钱 明1井宏宇 钱东华 (吉林大学第一医院呼吸内科，吉林 长春 130021)

目的 建立HSV-TK逆转录病毒包装细胞系并获得高产病毒的细胞株。方法 将TK基因与逆转录表达载体PLEGFP-N1连接后转染到包装细胞PA317中，经G418及荧光蛋白双重筛选得到高产病毒的细胞株。结果 经酶切鉴定成功构建PlEGFP-N1-TK重组载体，含HSV-TK基因重组逆转录病毒包装细胞PA317成功建立，经病毒滴度测定获得高产病毒的PA317/TK细胞株。结论 制备的重组病毒具有感染靶细胞的活性，为进一步应用HSV-TK基因进行肺癌的自杀基因治疗研究奠定基础。

HSV-TK;逆转录病毒;包装细胞PA317

恶性肿瘤的基因治疗是现代医学领域的研究热点，其中自杀基因疗法已经成为极富希望的肿瘤治疗新方法。自杀基因有多种，其中研究较多的主要有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)两种自杀基因系统。本实验应用HSV-TK/GCV系统将TK基因与逆转录表达载体PLEGFP-N1连接后转染到包装细胞PA317中，经筛选得到高产病毒的细胞株，为HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗肺癌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、菌种和细胞株 pGEM-5Zf-HSV-TK，日本东京大学医学部苏肃博士慧赠;PLEGFP-N1，吉林大学第一医院中心研究室保存;PA317细胞，购自Clontech公司;小鼠成纤维细胞(NIH3T3)细胞，购自中国科学院细胞库;大肠杆菌DH5α，由东北师范大学遗传病研究所实验室保存。

1.1.2 主要试剂 脂质体转染试剂盒，凯基生物公司;高纯度质粒提取试剂盒，TIANGE公司;DNA片段凝胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、DNA-Marker，TaKaRa公司;DNA测序，上海生工生物技术有限公司。

1.1.3 主要试剂的配制 LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母抽提物5 g/L、NaCl 10 g/L、pH7.0;LA液体培养基：在LB培养基中加入氨苄青霉素80 μg/ml。LB平板：LB培养基中按15 g/L浓度加入琼脂粉;LA平板：LA培养基中按15 g/L浓度加入琼脂粉;以上均需高压灭菌(15磅、20 min)。溶液Ⅰ：25 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，10 mmol/L EDTA.2Na(pH 8.0)，高压灭菌30 min，4℃冰箱中备用;溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，10%十二烷基硫酸钠(SDS)，室温保存，现用现配(0.2 mol/L，1%为终浓度);溶液Ⅲ：5 mol/L乙酸钾 300 ml，冰醋酸57.5 ml，无菌水142.5 ml，室温下混匀，4℃冰箱中备用。

1.1.4 主要仪器 CO2培养箱，SANYO日本;高速低温离心机、PCR仪，美国Bio-Rad公司;DYY-Ⅲ稳亚稳流电泳仪、电泳槽，美国Bio-Rad公司;凝胶成像系统，美国IBM公司;ZF型紫外透射反射分析仪、GNP型隔水式恒温培养箱，上海精宏实验技术有限公司;快速恒温数显水箱，常州国华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表达载体pLEGFP-N1-TK的构建与鉴定 将载体pGEM-5Zf-HSV-TK、PLEGFP-N1 1 μl加入一管已制备好的感受态细胞中〔1，2〕进行细菌转化;含有 pGEM-5Zf-HSV-TK、PLEGFPN1转化细菌大量培养及质粒的提取与纯化;质粒的提取与纯化，按照试剂盒说明操作。对pLEGFP-N1和pGEM-5Zf-HSVTK质粒DNA用BglⅡ和HindⅢ分别进行双酶切，酶切后的plEGFP质粒和目的DNA片段TK按1∶5摩尔比进行连接，反应体系10 μl：T4 DNA 连接酶1 μl，16 ℃ 过夜反应。将连接产物进行转化和筛选，之后进行重组载体的提取和鉴定，得到pLEGFP-N1-TK并进行重组质粒DNA的大量提取与纯化。

1.2.2 PLEGFP-N1-TK重组质粒的转染、克隆细胞株的转移和扩增 用Lipofectamine2000将PLEGFP-N1-TK重组质粒转染PA317细胞中，G418和倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白双重筛选;将筛选出的克隆细胞株转移并扩增，转移的细胞克隆生长相互融合达80%时，用胰酶消化后，将其转移入25 ml培养瓶中继续培养，维持G418浓度在300 μg/ml。待细胞生长良好后，挑取生长良好的细胞株进行传代扩增，用于病毒滴度测定。提取PA317和PA317/TK细胞DNA，用PCR检测HSVTK基因整合情况。

1.2.3 重组逆转录病毒滴度的测定 取对数生长期的NIH3T3细胞，加含10%的小牛血清高清DMEM培养液，调整细胞浓度为2×105/ml，按1 ml/孔加入24孔板中，37℃ 5%CO2培养至细胞达60%融合。将收集到的含HSV-TK基因PA317 克隆细胞的病毒上清液分别作 10-1，10-2，10-3，10-4倍稀释;倒去NIH3T3细胞培养孔内液体，分别吸取1.5 ml稀释的病毒液(含polybrene 8 μg/ml)加入培养孔内，不同稀释度病毒各加 2孔，置 37℃，5%CO2条件下培养 3 d;更换含800 μg/ml G418的培养液，继续培养7～10 d，其间每3～4 d换液一次。未感染病毒的NIH3T3细胞在加入等量的G418后，一般第3～5天开始死亡，第7～10天基本完全死亡;而感染病毒的NIH3T3细胞仍有细胞存活，并逐渐会有新的细胞开始生长。约2 w细胞克隆基本完成;统计细胞克隆数，计算病毒滴度。

病毒滴度(CFU/ml)=2瓶细胞克隆数的平均数×病毒稀释液倍数(其中CFU为colony forming units)。

2 结果

2.1 重组载体pLEGFP-TK构建 将pLEGFP-N1质粒和pGEM-5Zf-HSV-TK分别以HindⅢ和BglⅡ进行酶切，经回收纯化和连接反应，构建成功PlEGFP-N1-TK重组载体，行凝胶电泳。见图1，图2。

2.2 重组载体pLEGFP-N1-TK的酶切鉴定结果 重组质粒分别进行HindⅢ和BglⅡ双酶切，将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，结果在预期位置出现阳性条带与实验预想一致。见图3。

2.3 含HSV-TK基因重组逆转录病毒包装细胞PA317的建立

用脂质体转染法将载体pLEGFP-N1-TK导入PA317细胞，用400 μg/ml的G418筛选2 d后，细胞开始死亡;在4～5 d内死亡达高峰;5 d后有少数细胞贴壁生长;1 w后细胞逐渐形成阳性克隆细胞团;培养14 d后，筛选得到阳性克隆细胞。挑取其中生长较好的抗G418及带有绿色荧光的细胞克隆，再用含G418 800 μg/ml的低糖DMEM培养液进一步选择培养，最后形成的阳性克隆细胞命名为PA317/TK。见图4，图5。

2.4 PCR检测HSV-TK基因在PA317中整合情况 经PCR鉴定在PA317/TK细胞中检测到完整的约1.1 kb TK基因，而未转染TK基因的PA317细胞没有检测到TK基因。

2.5 PA317/TK细胞产病毒的滴度测定 用最终浓度800 μg/ml的G418筛选到的PA317/TK扩大培养后，收集病毒液，感染NIH3T3测定病毒滴度，结果为4×104cfu/ml。

图1 pLEGFP质粒双酶切图

图2 pGEM-5Zf-HSV-TK双酶切

图3 重组载体pLEGFP-N1-TK双酶切结果

图4 PA317/TK细胞在荧光纤维镜下表现(×400)

图5 经筛选形成阳性克隆细胞团(×400)

3 讨论

在目前的众多基因治疗实验中，逆转录病毒载体是被广泛采用的载体之一〔3〕，经过人工构建去除其中的3个功能基因(pol，gag，env)，保留了其中的长末端重复序列(LTR)和包装序列ψ的复制缺陷型病毒，因此它不具备感染细胞的能力。它必需与一种经过改造的含有辅助病毒基因组的包装细胞相互重组，将病毒RNA包装进去，才产生具有感染能力的完整病毒颗粒，此病毒颗粒能感染靶细胞，但不能复制〔4〕。PA317是逆转录病毒的包装细胞，其内有逆转录病毒的辅助病毒基因组。因此，本文通过把带有TK基因的逆转录病毒载体PLEGFP-N1导入PA317中，建立含HSV-TK重组逆转录病毒包装细胞。

逆转录病毒载体PLEGFP-N1包含一个选择标记新霉素磷酸转移酶基因(neo)，此外还有一个加强绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein，GFP)。当PLEGFP-N1-TK导入PA317后通过G418及GFP筛选得到细胞阳性克隆，在抗生素G418存在的培养基中，没有被导入PLEGFP-N1-TK的PA317细胞逐渐死亡，而导入PLEGFP-N1-TK的PA317细胞存活并逐渐生长，从而得到阳性细胞克隆PA317/TK。在G418筛选之前应做预实验，找出G418最适宜浓度，在最初筛选时应注意G418的浓度不能过高，待细胞生长稳定，neo基因在细胞中的表达达到一定程度时再改换高浓度的G418，以维持细胞克隆的筛选。本实验G418的初始筛选浓度为400 μg/ml，维持细胞克隆筛选浓度为800 μg/ml。由于逆转录病毒载体PLEGFP-N1含有GFP，所以通过倒置的荧光纤维镜观看被转染的PA317发出绿色荧光来进一步筛选阳性细胞克隆〔5〕。再通过病毒滴定度的测定挑选出产病毒较高的细胞株。

本实验将HSV-TK基因克隆至逆转录病毒表达载体PLEGFP-N1，经测TK基因序列正确后，用脂质体法将重组质粒导入逆转录病毒包装细胞PA317，包装后筛选出一株产感染性重组病毒细胞系PA317/TK，收集PA317/TK细胞培养上清液，再感染NI3T3细胞，测得病毒滴定度为4×104cfu/ml，从而证实了本实验制备的重组病毒具有感染靶细胞的活性，为进一步应用HSV-TK基因进行肺癌的自杀基因治疗研究奠定基础。

1 Culver KW，Ram Z，Wallbridge S，et al.In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors〔J〕.Science，1992;256(5063)：1550-2.

2 Vitek JA.Reliability of the“kiss of death”method for evaluation of intercellular communication：effect of cloning and culture technique〔J〕.Folia Biol(Praha)，1989;35(3)：171-6.

3 Jolly D.Viral vector systems for gene therapy〔J〕.Cancer Gene Ther，1994;1(1)：51-64.

4 Reeves L，Smucker P，Cornetta K.Packaging cell line characteristics and optimizing retroviral vector titer：the National Gene Vector Laboratory Experience〔J〕.Hum Gene Ther，2000;11(15)：2093-103.

5 Chalfie M，Tu Y，Euskirchen G，et al.Green fluorescent protein as a marker for gene expression〔J〕.Science，1994;263(5148)：802-5.

Q344+.13

A

1005-9202(2011)16-3101-03

吉林省卫生厅资助项目(No.1021Z031);吉林大学研究生创新基金(No.医学704053)

1 吉林大学口腔医院

钱东华(1965-)，女，副教授，硕士生导师，主要从事肺癌及肺部感染性疾病研究。

李 洋(1979-)，女，主治医师，博士，主要从事肺癌和哮喘的研究。

〔2011-01-29收稿 2011-03-25修回〕

(编辑 袁左鸣/徐 杰)