促红细胞生成素上调海马pCREB表达和改善脑缺血小鼠认知功能*

陈远寿， 潘贵书， 秦 伟， 罗孝美， 禹 静， 张 弛

(1遵义医学院生理教研室，贵州 遵义 563003；2中国科学院神经科学研究所神经科学国家重点实验室，上海 200031)

促红细胞生成素上调海马pCREB表达和改善脑缺血小鼠认知功能*

陈远寿1△， 潘贵书1， 秦 伟1， 罗孝美1， 禹 静2， 张 弛2

(1遵义医学院生理教研室，贵州 遵义 563003；2中国科学院神经科学研究所神经科学国家重点实验室，上海 200031)

目的探讨促红细胞生成素(EPO)对小鼠脑缺血所致的认知功能障碍和海马神经元损伤的保护作用及机制。方法C57BL/6绿色荧光蛋白转基因小鼠随机分为假手术(sham)组、脑缺血/再灌注(I/R)组和EPO治疗组；采用双侧颈总动脉阻断(2-VO)方法复制小鼠全脑缺血模型，跳台实验测试小鼠学习记忆能力，Nissl染色检测海马神经元存活情况，Western blotting检测磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(pCREB)表达水平，激光共聚焦显微镜和Neurolucida软件分析检测海马CA1区神经元形态及树突棘的变化。结果脑缺血导致小鼠学习记忆能力下降，海马CA1区神经元迟发性死亡和树突棘丢失；EPO治疗能显著提高脑缺血小鼠的学习记忆能力，减少脑缺血所致的海马CA1区神经元死亡和树突棘的丢失，显著上调海马CA1区神经元pCREB蛋白的表达。结论EPO可能通过上调pCREB的表达来保护神经元损伤、防止神经元树突棘的丢失，进而改善脑缺血小鼠的认知功能。

脑缺血； 红细胞生成素； cAMP反应元件结合蛋白质； 树突棘； 学习； 记忆

脑缺血可导致患者进行性或持久性的认知功能障碍，严重影响患者生活质量，目前尚无有效的干预手段。近年来发现，核转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)转录活性的改变与突触的可塑性及学习记忆功能有密切关系[1,2]。同时大量研究显示，促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)具有神经营养和神经保护作用，可改善啮齿类动物和人的认知功能[3,4]。但EPO对脑缺血后磷酸化CREB (phosphorylated CREB，pCREB)表达以及树突棘变化的影响少有报道。为此，本实验利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转基因小鼠，观察EPO治疗后脑缺血小鼠学习记忆能力、海马神经元损伤、pCREB表达以及树突棘的变化，深入探讨EPO的神经保护作用和改善脑缺血小鼠认知功能障碍的机制。

材 料 和 方 法

1材料

雄性C57BL/6 GFP转基因小鼠，质量25-30 g，2-3月龄，由中国科学院神经科学研究所转基因实验动物室提供。EPO购自Sigma；兔抗pCREB、GAPDH多克隆抗体购自Santa Cruz。DT-200小鼠跳台仪(成都泰盟公司)；显微镜(Nikon)；LSM510 META激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss)；CM1850冰冻切片机(Leica)。

2方法

2.1动物分组及给药 36只小鼠随机分为：假手术(sham)组、脑缺血/再灌注模型(ischemia/reperfusion,I/R)组、EPO治疗(EPO)组。每组12只。EPO治疗组小鼠于缺血前30 min和缺血/再灌注后每天腹腔内注射1次EPO(3 000 U/kg)，sham组和I/R组在相同时点注射等容量生理盐水。

2.2脑缺血/再灌注模型的制作 参照文献[5]，小鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg，ip)麻醉后，无菌操作下行颈部正中切口，分离、夹闭两侧颈总动脉20 min，松开小动脉夹行再灌注7 d。在手术造模和再灌注期间均应维持小鼠体温在(37±0.5)℃。Sham组小鼠进行同样的手术处理，但不进行两侧颈总动脉夹闭。

2.3行为学实验-跳台实验(step-down test) 测试 参照文献[6]行跳台实验检测小鼠学习记忆能力。实验第1 d先将小鼠放入箱内熟悉环境5 min，然后将小鼠放置于反应箱内的铜栅上，立即通36 V交流电，记录小鼠跳上安全台的反应时间(reaction time，RT)和5 min内从台上跳下受到的电击次数(错误次数，number of errors,NR)，以此作为学习成绩。24 h后进行重测验，将小鼠放在平台上，记录其第1次跳下平台的潜伏期(step-down latency，SDL)和5 min内受到电击的错误次数，此为记忆成绩。

2.4脑组织灌流及组织切片 小鼠跳台实验后，各组动物取8只，用10%水合氯醛(300 mg/kg，ip)麻醉，用0.9%生理盐水和4%多聚甲醛透心灌注固定，迅速取脑，避光下后固定过夜，分别用15%和30%蔗糖脱水直至脑组织沉下。行海马连续冠状冰冻切片(20 μm)。

2.5Nissl染色 海马切片浸入1∶1乙醇和氯仿溶液中30 min，梯度乙醇(100%, 95%,80%, 70%, 60%, 50%)分化，蒸馏水冲洗后用甲酚紫染液浸染30 min，蒸馏水洗，用梯度乙醇(50%, 60%, 70%, 80%, 95 %, 100%)脱水，二甲苯透明(2×5 min)，DPX封片，显微镜明场下观察海马神经元形态学变化。各组选取切片8张，在显微镜下对海马CA1区存活神经元计数分析。

2.6海马CA1神经元图像采集及树突棘的形态定量分析 取各组海马切片，应用LSM510 META激光扫描共聚焦显微镜逐层扫描拍摄转染有GFP的海马CA1锥体细胞，扫描拍摄图像经过Neurolucida软件绘制并重塑神经元结构，用NeuroExplorer软件统计出二级树突的树突棘密度。

2.7Western blotting检测pCREB的表达 小鼠跳台实验后，各组动物取4只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后迅速断头取脑，冰上分离出海马CA1区组织，立即置-70 ℃冰箱保存。取出标本冰上裂解、匀浆，4 ℃离心后取上清，以考马斯亮蓝法测定样品蛋白含量。将等量蛋白样品经12%SDS-PAGE分离后，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭4 ℃过夜，洗涤后加pCREBⅠ抗(1∶1 000)室温摇晃2 h，洗涤后，加入Ⅱ抗辣根酶标记山羊抗兔IgG (1∶4 000)室温摇晃1 h。洗涤后暗室内ECL反应，曝光、显影、定影。应用数字凝胶成像系统拍照，将目的蛋白条带的灰度值与内参照GAPDH的灰度值做比较，计算相对灰度值。

3统计学处理

结 果

1EPO提高脑缺血小鼠学习记忆能力

行为学结果显示，第1次测试时，受电击后I/R组小鼠的反应时间较sham组明显延长(Plt;0.01)，错误次数也明显增多(Plt;0.01)；EPO组小鼠的反应时间较I/R组明显缩短(Plt;0.01)，错误次数也明显减少(Plt;0.05)；24 h后第2次测试发现，I/R组的SDL与sham组比较明显缩短(Plt;0.01)，EPO组的SDL较I/R组明显延长(Plt;0.01)，错误次数也显著减少(Plt;0.05)，见表1。

表1 各组小鼠学习记忆能力比较

2EPO保护脑缺血所致的海马神经元损伤

Nissl染色和定量分析显示，与sham组比较，I/R组CA1区神经元存活数量显著减少(Plt;0.01)；EPO组CA1区神经元存活数量明显多于与I/R组 (Plt;0.01)，但仍低于sham组(Plt;0.01)，见图1。

Figure 1. Effect of EPO on CA1 neuronal injury after ischemia.A：histological evaluation with Nissl staining (left panels×40，right panels×400); B：quantitative evaluation. ±s. n=8. **Plt;0.01 vs sham group ； ## Plt;0.01 vs I/R group.

3EPO减少脑缺血所致的小鼠海马CA1区神经元树突棘的丢失

与sham组比较，I/R组CA1区神经元树突棘明显脱落、数量显著减少(Plt;0.01)；EPO治疗后，CA1区神经元树突棘数量明显多于I/R组(Plt;0.01)，见图2。

Figure 2. Effect of EPO on dendritic spine density in hippocampal CA1 neuron after ischemia.A：histological evaluation under laser scanning confocal microscope (×1 000);B：quantitative evaluation±s. n=8. ** Plt;0.01 vs sham group ； ##Plt;0.01 vs I/R group.

4EPO上调脑缺血小鼠海马CA1区神经元pCREB蛋白的表达

与sham组比较，I/R组海马CA1区pCREB蛋白表达有所降低，但无显著差异(Pgt;0.05)；EPO治疗后，pCREB蛋白表达显著高于sham组与I/R组(Plt;0.05)，见图3。

Figure 3. Effect of EPO on pCREB protein expression in the hippocampal CA1 region after ischemia.A：Western blotting analysis;B：quantitative evaluation. ±s. n=4. *Plt;0.05 vs sham group；#Plt;0.05 vs I/R group.

讨 论

大量临床和实验研究均表明，脑缺血再灌注可导致大脑缺血缺氧易感区海马发生迟发性神经元死亡，导致患者或动物的认知功能障碍[6,7]。本研究也显示，小鼠脑缺血再灌注7 d后，海马CA1区发生明显的神经元死亡，且伴学习记忆能力明显减退，表明本实验的脑缺血再灌注模型是成功的。同时，本研究发现脑缺血再灌注7 d后海马CA1区锥体神经元树突棘数量明显减少，引起了突触可塑性改变，而突触可塑性是学习记忆的神经生物学基础，在学习记忆过程中，突触可塑性变化常与树突棘的形成、脱落、扩张和萎缩等形态变化相伴发生[8]。缺血后树突棘的丢失可能是小鼠学习记忆能力减退的原因之一。

EPO作为一种热稳定糖蛋白激素，具有神经保护作用[9]和神经营养作用[10]，可促进神经细胞增殖和分化，使神经元突起增多，突触功能增强[11-13]。我们实验结果发现，EPO对小鼠脑缺血所致的海马CA1区神经元损伤有明显保护作用，可阻止脑缺血引起的CA1区神经元树突棘的丢失。树突棘是神经元间形成突触的主要部位，EPO削弱了脑缺血所致的树突棘丢失，从而增加了海马CA1区神经元突触的数量，使脑缺血小鼠的学习记忆能力提高。提示EPO可能会成为一种防治血管性认知功能障碍有希望的药物。

为进一步研究EPO上述作用的可能机制，我们研究了学习记忆的关键分子CREB。在早期研究CREB在学习记忆中的作用发现，利用热冲击条件诱导一个CREB的抑制蛋白表达后，可阻断果蝇长时程记忆的形成。通过转基因动物实验也证明，CREB缺失的突变型小鼠空间学习记忆功能明显受损[14]。而pCREB是CREB的活化形式，调节位于其下游的大量基因如即刻早期基因、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等基因的转录，参与了神经元生长、分化、存活，以及学习记忆等重要作用[1,2,15,16]。本研究结果中I/R组pCREB表达并未下调，与文献报道一致[17,18]。也有报道在脑缺血早期，pCREB表达可快速上调(5 min内)，然后逐步回落[17]，现在认为这可能是机体对缺血脑损伤的一种内源性保护效应[17,18]。同时，我们观察到EPO治疗后，脑缺血小鼠海马CA1区pCREB的表达明显上调，小鼠认知功能得到明显改善。这些结果提示，刺激脑缺血小鼠海马CREB的转录活性可能是EPO发挥神经保护及其促进学习记忆作用的机制之一。

综上所述，本研究结果证实，EPO可明显削弱脑缺血/再灌注所致的小鼠海马CA1锥体神经元损伤和树突棘的减少，改善脑缺血引起的小鼠认知功能缺陷，提高脑缺血小鼠学习记忆能力，其机制可能与上调海马CA1锥体神经元pCREB的表达以及改变海马突触可塑性有关。这为探讨EPO的神经保护作用和提高学习记忆能力的分子机制补充了新内容，为临床上防治缺血脑损伤与认知功能缺陷提供了实验依据和新的思路。

[1] Sekeres MJ，Neve RL，Frankland PW，et al. Dorsal hippocampal CREB is both necessary and sufficient for spatial memory[J]. Learn Mem，2010，17(6)：280-283.

[2] Xu J，Rong S，Xie B，et al. Memory impairment in cognitively impaired aged rats associated with decreased hippocampal CREB phosphorylation: reversal by procyanidins extracted from the lotus seedpod[J]. J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2010，65(9)：933-940.

[3] Kumral A，Uysal N，Tugyan K，et al. Erythropoietin improves long-term spatial memory deficits and brain injury following neonatal hypoxia-ischemia in rats[J]. Behav Brain Res，2004，153(1)：77-86.

[4] Adamcio B, Sargin D, Stradomska A, et al. Erythropoietin enhances hippocampal long-term potentiation and memory[J]. BMC Biol，2008，6：37.

[5] Kim DH，Kim S，Jung WY，et al.The neuroprotective effects of the seeds of Cassia obtusifolia on transient cerebral global ischemia in mice[J]. Blood Chem Toxicol，2009，47(7)：1473-1479.

[6] Zhang L，Fu F，Zhang X，et al. Escin attenuates cognitive deficits and hippocampal injury after transient global cerebral ischemia in mice via regulating certain inflammatory genes[J]. Neurochem Int，2010，57(2)：119-127.

[7] 刘 旭，程玉芳，张汉霆，等. 咯利普兰对局灶性脑缺血-再灌注损伤大鼠学习记忆及海马PDE4活性的影响[J]. 中国病理生理杂志，2008，24(6)：1096-1100.

[8] González-Burgos I，Letechipía-Vallejo G，López-Loeza E，et al.Long-term study of dendritic spines from hippocampal CA1 pyramidal cells, after neuroprotective melatonin treatment following global cerebral ischemia in rats[J]. Neurosci Lett，2007，423(2)：162-166.

[9] Wakida K，Shimazawa M，Hozumi I，et al. Neuroprotective effect of erythropoietin,and role of metallothionein-1 and-2,in permanent focal cerebral ischemia[J].Neuroscience，2007，148 (4)：105-114.

[10]Li Y，Lu ZY，Keogh CL，et al. Erythropoietin-induced neurovascular protection,angiogenesis,and cerebral blood flow restoration after focal ischemia in mice [J].J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(5)：1043-1054.

[11]Gonzalez FF，McQuillen P，Mu DZ，et al. Erythropoietin enhances long-term neuroprotection and neurogenesis in neonatal stroke[J].Dev Neurosci，2007，29(4-5)：321-330.

[12]Ransome MI，Turnley AM. Erythropoietin promotes axonal growth in a model of neuronal polarization[J]. Mol Cell Neurosci，2008，38(4)：537-547.

[13]Berkingali N，Warnecke A， Gomes P，et al. Neurite outgrowth on cultured spiral ganglion neurons induced by erythropoietin[J]. Hear Res，2008，243(1-2)：121-126.

[14]Bourtchuladze R，Frenguelli B，Blendy J，et al. Deficient long-term memory in mice with a targeted mutation of the cAMP-responsive element-binding protein[J].Cell，1994，79(1)：59-68.

[15]Viviani B，Bartesaghi S，Corsini E，et al.Erythropoietin protects primary hippocampal neurons increasing the expression of brain-derived neurotrophic factor[J].J Neurochem，2005，93(2)：412-421.

[16]蔡晓红，张存雪，周永海，等.慢性间歇低氧对幼鼠认知及相关脑区CREB的影响[J].中国病理生理杂志，2010,26(5):895-900.

[17]Mabuchi T, Kitagawa K, Kuwabara K, et al. Phosphorylation of cAMP response element-binding protein in hippocampal neurons as a protective response after exposure to glutamateinvitroand ischemiainvivo[J]. J Neurosci，2001，21(23)：9204 -9213.

[18]Kitagawa K. CREB and cAMP response element-mediated gene expression in the ischemic brain[J]. FEBS J，2007，274(13)：3210-3217.

Erythropoietinattenuatescerebralischemia-inducedcognitivedysfunctionthroughstimulationofhippocampalCREBphosphorylationinC57BL/6mice

CHEN Yuan-shou1, PAN Gui-shu1, QIN Wei1, LUO Xiao-mei1, YU Jing2, ZHANG Chi2

(1DepartmentofPhysiology,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China;2InstituteofNeuroscience,StateKeyLaboratoryofNeuroscience,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200031,China.E-mail:jcbshengli@163.com)

AIM: To investigate the neuroprotective effect of erythropoietin (EPO) on cognitive dysfunction and neuronal injury in hippocampal CA1 region induced by cerebral ischemia in mice.METHODSMale C57BL/6 green fluorescent protein-transgenic mice were randomly divided into 3 groups: sham operation group (sham), ischemia/reperfusion group (I/R) and EPO-treated group. Transient cerebral global ischemia was induced by bilateral common carotid artery occlusion (2-VO). The step-down test was used to measure the capacity of learning and memory of the animals in each group. Nissl staining was applied to examine the neuronal number in hippocampal CA1 region. The expression of phosphorylated cAMP response element-binding protein (pCREB) was determined by Western blotting. Alterations of dendritic morphology in hippocampal CA1 region were evaluated using laser scanning confocal microscopy and Neurolucida software.RESULTSTransient cerebral ischemia caused deficits of spatial learning and memory, and delayed neuronal death and loss of dendritic spines in hippocampal CA1 region were also obvious. The EPO treatment significantly improved the cognitive function in cerebral ischemic mice, and the protein expression of pCREB was obviously increased. At the same time, neuronal death and loss of dendritic spines were reduced in hippocampal CA1 region.CONCLUSIONErythropoietin increases the protein expression of pCREB, and reduces neuronal death and loss of dendritic spines. These processes may be responsible for erythropoietin-mediated neuroprotective effects and the improvement of cognitive function in cerebral ischemic mice.

Brain ischemia; Erythropoietin; cAMP response element-binding protein; Dendritic spine; Learning; Memory

1000-4718(2011)04-0722-05

R743.31

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.019

2010-10-10

2011-01-20

中国科学院神经科学国家重点实验室开放课题资助项目(No.SKLN2008A04)

△通讯作者Tel：0852-8609442；E-mail：jcbshengli@163.com