骨碎补总黄酮对去卵巢骨质疏松模型大鼠血清中瘦素、白细胞介素6、前列腺素E2及骨组织中β2-肾上腺素受体的影响*

孙 影， 杨 丽， 吕辰鹏， 方 霁， 左 娜， 沈家珍， 张荣华，△

(暨南大学 1药学院中药学教研室，2医学院中医系，广东 广州 510632)

骨碎补总黄酮对去卵巢骨质疏松模型大鼠血清中瘦素、白细胞介素6、前列腺素E2及骨组织中β2-肾上腺素受体的影响*

孙 影1， 杨 丽1， 吕辰鹏1， 方 霁2， 左 娜1， 沈家珍2， 张荣华1，2△

(暨南大学1药学院中药学教研室，2医学院中医系，广东 广州 510632)

目的观察骨碎补总黄酮对去卵巢骨质疏松(OP)模型大鼠血清中瘦素(LEP)、白细胞介素6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)及骨组织中β2-肾上腺素受体(ADRB2)的影响。方法采用双侧卵巢切除法复制OP大鼠模型；造模12周后以双能X线法检测骨矿物质密度(BMD)，确定OP模型是否复制成功；用药12周后应用酶联免疫法检测血清中LEP、IL-6和PGE2的浓度，免疫组化法检测大鼠骨组织中ADRB2的表达。结果造模12周后，模型组与假手术组相比，多个部位BMD显著下降(Plt;0.01)，提示OP模型复制成功。用药12周后模型组LEP、IL-6和PGE2较假手术组均有显著增高(Plt;0.05)；骨碎补总黄酮组LEP和IL-6较模型组有明显降低(Plt;0.01)，PGE2无显著差异(Pgt;0.05)；模型组ADRB2表达与假手术组和给药组间比较有显著差异(Plt;0.05)，假手术组和给药组间比较无显著差异(Pgt;0.05)。结论去卵巢OP大鼠血清LEP、IL-6、PGE2和骨组织ADRB2表达升高；而骨碎补总黄酮能降低去卵巢OP大鼠血清中LEP、IL-6水平和骨组织ADRB2表达，抑制骨吸收，这可能是骨碎补总黄酮防治OP的作用机制之一。

骨碎补总黄酮； 瘦素； 白细胞介素6； 前列腺素E2； 受体,肾上腺素能，β2； 骨质疏松

骨碎补具有补肾、强骨的功效，其主要活性成分骨碎补总黄酮对骨质疏松(osteoporosis，OP)有较好的疗效[1]。本实验通过观察骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠OP模型血清中瘦素(leptin，LEP)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)及骨组织中β2-肾上腺素受体(β2-adrenergic receptor，ADRB2)的影响，试图了解骨碎补总黄酮治疗OP的可能机制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1药物、试剂与仪器 骨碎补总黄酮(强骨胶囊，北京岐黄药业生产；1 g相当于66.7 g生药，每粒含总黄酮1.8 g)；华美试剂盒(产品编号为CSB-E07967r、CSB-E04640r、CSB-E07433r)；SA1022兔IgG试剂盒(博士德生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒(博士德生物技术有限公司);ADRB2多克隆兔抗鼠抗体(博士德生物技术有限公司)。TECAN酶标仪(型号：Sunrise Remote/Touch Screen,南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)；微量有机分析专用超纯水机(颐洋企业发展有限公司)；恒温生化培养箱(宁波江南仪器厂)；CU420型电热恒温水箱(上海一恒科技有限公司)；MC-1180显微镜(广州粤显光学仪器有限责任公司)；TS-8型转移脱色摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2动物 3月龄SD雌性大鼠45只(SPF级)，体重为(248.2±12.0)g，由广东省医学实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK(粤)2008-0002。

1.3受试环境 暨南大学药学院实验动物中心，各组动物均饲养于专用鼠笼内，每笼5只，室温调节在(24±2) ℃，自由摄食与饮水。

2方法

2.1动物分组及模型复制 经过2周环境适应，运用Excel函数进行完全随机实验分组，将大鼠随机分为假手术组(15只)、模型组(30只)。OP模型复制，具体操作参照文献法[2，3]，造模12周后双能X线法检测骨矿物质密度(bone mineral density，BMD)，在确定OP模型复制成功后，将模型组随机分为模型空白组以及骨碎补总黄酮组，每组15只。假手术组做同样切口，找到卵巢后不切除，直接缝合伤口。

2.2药物干预及标本采集 模型复制成功后进行药物干预，每周称重1次，根据体重调整给药量。骨碎补总黄酮组给药量50 mg·kg-1·d-1。空白组及模型组给予等体积的蒸馏水灌胃。药物干预12 周后，处死动物，心脏取血，离心取血清，每份血清分装3-4个冷冻管中，每管1-2 mL，置-80 ℃低温冰箱保存，待用。取出大鼠左右股骨，4%多聚甲醛固定，固定好的骨组织进行微波辐射脱钙直至骨组织软化，以能用针头顺利刺进骨皮质为宜，脱钙成功后，恒温冷冻机切片，组织片经过清洁处理后直接贴片，待用。

2.3ELISA法检测LEP、IL-6和PGE2的表达 分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL，37 ℃反应120 min。弃去液体，甩干，不洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，37 ℃温育。温育60 min后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2 min，200 μL/well，甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，37 ℃，60 min。温育60 min后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2 min，200 μL/well，甩干。依序每孔加入底物溶液90 μL，37 ℃避光显色。依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应。用酶联仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度值(A值)。

2.4免疫组化法检测骨组织ADRB2的表达 脱蜡和水化：组织切片置于二甲苯中浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min；无水乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；90%乙醇中浸泡5 min；80%乙醇中浸泡5 min；70%乙醇中浸泡5 min；蒸馏水中浸泡5 min。蒸馏水洗3次各5 min。用3%H2O2内源性灭活10 min，蒸馏水洗3次各5 min。胰酶修复37 ℃，10 min。PBS洗3次每次3 min。滴加5%BSA封闭液，室温15 min，甩去多余液体。滴加Ⅰ抗(稀释100倍)，4 ℃过夜，PBS洗3次每次2 min。滴加生物素化Ⅱ抗, 37 ℃ 20 min，PBS洗3次每次2 min。滴加链霉素化亲和素试剂，37 ℃ 20 min，PBS洗4次，每次5 min。DAB显色10 min(镜下掌握显色程度)。蒸馏水洗。苏木素复染1 min，Na2HPO4饱和。脱水、透明、封片、免疫组化阳性结果判断标准按照参考文献[4]制定，利用Leica正立电动显微镜，每组随机抽取5张骨组织切片，400倍的高倍镜下每个组织片随机选取5个能代表该组织片特点的视野，观察大鼠骨组织ADRB2的表达。

3统计学处理

结 果

1BMD检测结果

造模12周后模型组和假手术组随机抽取样本，双能X线法检测BMD，结果见表1。模型组与假手术组相比，多个部位BMD明显下降，差异显著(Plt;0.01)，提示模型组大鼠骨量显著丢失，造模成功。

表1 造模12周后模型组与假手术组大鼠的BMD

2各组大鼠血清中LEP、IL-6和PGE2的浓度

结果见表2，药物干预12 周后模型组LEP含量较假手术组明显增高(Plt;0.01)，骨碎补总黄酮组较模型组明显降低(Plt;0.01)；模型组IL-6含量较假手术组明显增高(Plt;0.01)，骨碎补总黄酮组较模型组明显降低(Plt;0.01)；模型组PGE2含量较假手术组有明显增高(Plt;0.05)。骨碎补总黄酮组PGE2含量低于模型组，但无显著差异(Pgt;0.05)。

表2 药物干预12 周后各组大鼠血清LEP、IL-6和PGE2的水平

3各组大鼠骨组织ADRB2的表达

药物干预12周后检测各组大鼠骨组织ADRB2的表达，结果见图1和表3。假手术组ADRB2表达明显低于模型组，差异显著(Plt;0.05)；给药组ADRB2表达明显低于模型组，差异显著(Plt;0.05)，与假手术组比较无显著差异(Pgt;0.05)。

Figure 1. ADRB2 expression in bone of rats by immnunohistochemistry(×400).A:negative group;B:sham group;C:model group;D:treatment group.

表3 药物干预12 周后各组大鼠骨组织ADRB2的阳性表达数

讨 论

OP是一种以骨量低下、骨微结构破坏，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性疾病。OP的发病机制复杂，影响因素很多[5]，近期研究发现骨组织内神经功能异常对骨代谢失衡及OP的发病有重要影响[6]。骨组织不仅能通过神经骨骼信号通路调节骨骼系统微循环营养环境，还直接通过交感神经末梢释放神经递质。其中神经递质LEP介导的交感神经活动能抑制骨组织形成[6]，LEP通过交感神经作用于骨组织上的效应器是成骨细胞(osteoblast，OB)，作用受体是ADRB2，而ADRB2被激活后可促进IL-6和PGE2的表达[7]，进而刺激破骨细胞(osteoclast，OC)生成和分化，从而导致骨量的下降。

本实验模型组大鼠血清中LEP、IL-6和PGE2水平均显著高于假手术组(Plt;0.05)，说明去卵巢大鼠OP发生过程中确实存在血清中LEP、IL-6和PGE2水平升高现象。

血清中LEP水平可限制骨高转换导致的骨丢失，从而对OP发生保护作用。本实验研究发现骨碎补总黄酮组LEP含量明显低于模型组(Plt;0.01)，接近假手术组。说明骨碎补总黄酮能纠正大鼠血清中LEP的上升；骨碎补总黄酮组ADRB2表达明显低于模型组(Plt;0.05)，说明骨碎补总黄酮能纠正大鼠骨细胞ADRB2的高表达。IL-6是促进骨组织吸收的重要细胞因子，OB和OC膜上都存在IL-6受体，交感神经可通过IL-6等刺激OB和间质细胞上分泌核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)影响骨吸收[8,9]。本实验研究发现骨碎补总黄酮组IL-6含量明显低于模型组(Plt;0.01)，与假手术组无差别，其变化趋势与LEP相同。由此推测骨碎补总黄酮通过抑制LEP的表达，抑制其下游因子IL-6的表达。PGE2在维持OB与OC的平衡中起着重要作用，它通过对破骨前体细胞表达的RANKL进行调控，刺激OC分化，抑制其凋亡。本实验研究发现骨碎补总黄酮组PGE2含量与模型组相比无显著差异(Pgt;0.05)，但此结果尚不能说明骨碎补总黄酮治疗OP与PGE2完全无关，其与去卵巢大鼠血清PGE2的关系仍需进一步探讨。

综上所述，去卵巢OP大鼠血清LEP、IL-6、PGE2和骨组织ADRB2表达升高，而骨碎补总黄酮能降低去卵巢OP大鼠血清中LEP、IL-6水平和骨组织ADRB2表达，抑制骨吸收，这可能是骨碎补总黄酮防治OP的作用机制之一。

[1] 王和鸣，葛继荣，田金洲，等. 强骨胶囊治疗原发性骨质疏松症临床试验[J]. 中药新药与临床药理，2004，15(4): 284-287.

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[5] 杨 丽，张荣华，蔡 宇，等.去卵巢对SD大鼠MSCs生物学特性的影响[J].中国病理生理杂志，2010，26(7)：1249-1254.

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Effectsofdrynariatotalflavonoidsonserumlevelsofleptin,interleukin6,prostaglandinE2andexpressionofboneβ2-adrenergicreceptorinovariectomizedosteoporosisrats

SUN Ying1, YANG Li1, LÜ Chen-peng1, FANG Ji2, ZUO Na1, SHEN Jia-zhen2, ZHANG Rong-hua1, 2

(1DepartmentofChineseMateriaMedica,PharmacyCollege,2DepartmentofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tzrh@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of drynaria total flavonoids on serum levels of leptin (LEP), interleukin 6(IL-6), prostaglandin E2(PGE2) and the expression of bone β2-adrenergic receptor (ADRB2) in a rat model of ovariectomized osteoporosis(OP).METHODSThe osteoporosis model was established by ovariectomy. Twelve weeks after modeling,bone mineral density (BMD) was determined by dual-energy X-ray absorptiometry to verify successful modeling.Enzyme-linked immunosorbent assay was applied to detect the concentrations of LEP, IL-6 and PGE2in serum. The expression of ADRB2 was determined by immunohistochemical technique.RESULTSCompared with sham group,BMD of the rats in model group significantly decreased in multiple regions 12 weeks after modeling(Plt;0.01). The serum levels of LEP, IL-6 and PGE2in model group were significantly higher than those in sham group(Plt;0.05). The levels of LEP, IL-6 and PGE2in drynaria total flavonoids group were significantly lower than those in model group(Plt;0.01). No significant difference of PGE2between these 2 groups was observed. The ADRB2 expression in sham group and treatment group was significantly different from that in model group, and no significant difference between sham group and treatment group was found.CONCLUSIONThe serum levels of LEP, IL-6 and PGE2and the expression of bone ADRB2 increased in OP rats.Drynaria total flavonoids reduce the production of LEP, IL-6 and the expression of ADRB2, and suppress the bone absorption, which may be one of the mechanisms in treating OP.

Drynaria total flavonoids; Leptin; Interleukin 6; Prostaglandin E2; Receptors,adrenergic,beta-2; Osteoporosis

1000-4718(2011)04-0755-04

R361+2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.025

2010-12-09

2011-01-25

国家自然科学基金资助项目(No.30772885)

△通讯作者Tel：020-85228578；E-mail：tzrh@jnu.edu.cn