补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马cAMP-PKA-CREB信号通路的影响*

张泓波， 高维娟， 钱 涛， 唐敬龙， 李 君

(承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000)

补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马cAMP-PKA-CREB信号通路的影响*

张泓波， 高维娟△， 钱 涛， 唐敬龙， 李 君

(承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000)

目的观察补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马组织环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)-cREB反应元件结合蛋白(CREB)信号通路的影响。方法将大鼠随机分为补阳还五汤组、尼莫地平组、模型组、假手术组。用改良Pulsinelli’s四血管阻断法建立血管性痴呆大鼠模型,分别给予相应的药物，连续30 d。利用放射免疫分析法检测海马组织cAMP含量，Western blotting法检测PKA催化亚基(PKAc)蛋白表达，电泳迁移率改变分析法检测CREB的DNA结合活性。结果与假手术组比较, 模型组大鼠海马组织cAMP含量、PKAc蛋白表达和CREB的DNA结合活性均降低(Plt;0.01)；与模型组比较，补阳还五汤组和尼莫地平组cAMP含量、PKAc蛋白表达和CREB的DNA结合活性均升高(Plt;0.01)。结论补阳还五汤可增加血管性痴呆大鼠海马cAMP含量、PKAc蛋白表达和CREB的DNA结合活性，增强cAMP-PKA-CREB信号通路的作用。

补阳还五汤； 痴呆,血管性； cAMP； 蛋白激酶A； cAMP反应元件结合蛋白质

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是指由脑血管因素所导致的智能障碍综合征。学习和记忆是脑的高级功能，其中枢主要位于海马。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)-蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)-cAMP反应元件结合蛋白 (cAMP response element-binding protein，CREB) 信号转导通路在学习记忆中起着重要的作用。在该通路中，细胞膜上的G蛋白耦联受体与胞外神经递质等配体结合后活化，刺激腺苷酸环化酶(adenyl cyclases，AC)增加胞内cAMP浓度。在长时程记忆形成期间，cAMP与PKA的调节亚基R结合，导致催化亚基C(PKAc)释放并移位至细胞核，使包括CREB在内的多种蛋白质磷酸化。磷酸化后的CREB可增强多种靶基因的表达，形成新的突触联系，从而使获得的信息得以长期储存，即形成长时程记忆[1,2]。补阳还五汤是益气活血中药的经典名方，在临床上可改善血管性痴呆患者的智能损伤，但其作用机制尚不清楚。为此，本研究观察了补阳还五汤对VD大鼠海马cAMP含量、PKAc蛋白表达和CREB的DNA结合活性的影响，从而探讨cAMP-PKA-CREB信号通路在补阳还五汤治疗VD中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物与分组 健康成年SD雄性大鼠，鼠龄(5-6)个月，体重(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2007-0001，SPF级]。随机分为假手术(sham-operation)组、模型(VD model)组、补阳还五汤(Buyanghuanwutang,BYHWT treatment)组和尼莫地平(nimodipine treatment)组，每组6只。

1.2药物及制备 补阳还五汤购自承德北京同仁堂药店分店，补阳还五汤原方(黄芪120 g，当归尾6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，桃仁3 g，红花3 g，地龙3 g)水煎2次，煎液合并浓缩后使药液浓度为含生药6 250 g·L-1。尼莫地平为天津华津制药厂生产(批号为080317)，20 mg,溶于双蒸水制成2.5 g·L-1的混悬液。高压灭菌，置4 ℃冰箱保存备用，用前混匀。

1.3主要试剂和仪器 环磷酸腺苷放射免疫分析试剂盒([125I]-cAMP RIA,上海中医药大学同位素实验室)；兔抗PKAc单克隆抗体(Abcam)；羊抗兔IgG (KPL)；兔抗β-actin多克隆抗体( Santa Cruz)；CREB寡聚核苷酸探针(上海英俊生物工程有限公司)；核蛋白抽提试剂盒(Pierce)；EMSA试剂盒(Roche)； GC-911-Y-放射免疫计数器(中国科学技术大学科技实业总公司)；Quantity one凝胶分析系统(Bio-Rad)。

2方法

2.1模型建立 采用改良的Pulsinelli’s四血管阻断(four-vessel occlusion，4-VO )[3]方法。VD大鼠模型：将大鼠行背侧颈正中切口，用直径0.5 mm的电凝针烧灼双侧第1颈椎横突翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞。24 h后行腹侧颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5 min×3 次，每次间隔1 h。假手术组：只做皮肤切口和组织分离处理，不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭。

2.2给药及取材 各组大鼠术后清醒开始灌胃给药。补阳还五汤组：给予补阳还五汤50 g·kg-1·d-1；尼莫地平组：给予尼莫地平20 mg·kg-1·d-1；模型组和假手术组均给予生理盐水10 mL·kg-1·d-1。连续给药30 d。第30 d断头处死，在低温修块台上分离出双侧海马组织，置液氮中保存。

2.3放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)检测海马组织cAMP含量 取各组海马组织50 mg，放入盛有4 ℃、2 mL、50 mmol/L的醋酸缓冲液(pH 4.75)的匀浆器中充分匀浆。加入2 mL无水乙醇冲洗匀浆器后与匀浆液合并，混匀，静置5 min，3 500 r/min离心15 min；将上清液收集在青霉素小瓶内。再用75%乙醇2 mL洗沉淀，匀浆分散混匀，3 500 r/min离心15 min。合并上清液，60 ℃烘箱中烘干，4 ℃保存。cAMP含量的测定按试剂盒说明书操作进行，用nmol/g湿重表示。

2.4Western blotting 检测海马组织PKAc蛋白水平 取海马组织，提取总蛋白并用BCA法测定蛋白浓度定量。各样本蛋白上样量为15 μg，经 12% SDS-PAGE积层胶80 V，分离胶120 V(恒压)电泳，300 mA(恒流)4 ℃转膜2.5 h。用5%TBST-脱脂奶粉封闭2 h，后加入兔抗PKAc单抗(1∶2 500)、兔抗β-action(1∶600)4 ℃过夜。Ⅱ抗孵育1 h，TBST洗5 min×3次。经ECL发光显影，曝光后将显影图像扫描至电脑进行分析。结果以目标条带的吸光度A值与同一样本β-action蛋白的A值的比值表示。

2.5电泳迁移率改变分析法(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)测定CREB的DNA结合活性 取海马组织按核蛋白提取试剂盒提供的操作规程提取核蛋白。BCA法进行蛋白定量后-80 ℃保存。设计CREB DNA结合序列 ：5’-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGAGCTAG-3’。探针标记参照DIG Gel Shift Kit操作手册进行。标记反应结束后调整探针浓度为15.5 pmol/L。取各样本核蛋白4 μg与标记的寡核苷酸探针2 μL 25 ℃孵育15 min。采用6%非变性聚丙烯酰凝胶4 ℃ 80 V电泳分离DNA-核蛋白结合体。电泳完毕将DNA-核蛋白结合体转移到带正电荷的尼龙膜，化学发光法检测特异性条带。经曝光、显影和定影后将图像扫描至电脑进行分析。

3统计学处理

结 果

1补阳还五汤对VD大鼠海马组织cAMP含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织cAMP含量显著降低(Plt;0.01)；与模型组比较，尼莫地平组与补阳还五汤组海马组织cAMP显著升高(Plt;0.01)，见表1。

表1 各组大鼠海马cAMP含量的比较

2补阳还五汤对VD大鼠海马组织PKAc蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织PKAc蛋白表达水平显著降低(Plt;0.01)；与模型组比较，尼莫地平组大鼠海马组织PKAc蛋白表达水平与补阳还五汤组大鼠海马组织PKAc蛋白表达水平显著升高(Plt;0.01)，见图1。

3补阳还五汤对VD大鼠海马组织CREB的DNA结合活性的影响

经EMSA检测和对特异性寡核苷酸与核蛋白的结合条带的密度扫描和分析发现：与假手术组比较，模型组大鼠海马组织CREB的DNA结合活性显著降低(Plt;0.01)；与模型组比较，尼莫地平组与补阳还五汤组大鼠海马组织CREB结合活性显著升高(Plt;0.01)；尼莫地平组、补阳还五汤组大鼠海马组织CREB的结合活性之间无明显差异(Pgt;0.05)，见图2。

讨 论

cAMP作为第二信使在记忆巩固后期阶段有重要作用[4]。cAMP对学习记忆绝大多数功能作用是通过激活PKA实现的。PKA是神经细胞内信号转导系统中重要的调节蛋白磷酸化的激酶，它的活化可参与突触功能、神经活性物质的合成与释放、受体敏感性及脱敏和基因表达等的调控，是记忆形成的必要条件[5]。CREB在记忆活动中作为从共价修饰短期过程到转录依赖长期过程的枢纽，是长期记忆形成过程所必需的关键调节分子。它可在多种信号通路激酶的作用下实现Ser133磷酸化而活化，其中研究最为透彻的为cAMP-PKA信号通路[6]。Ser133位点的磷酸化调节位于CREB下游的基因(如即刻早期基因immediate-early genes，IEGs)表达和转录，从而参与长时相增强的形成、增加沉默突触数量、建立新的突触联系，参与神经元的竞争和选择，利于神经元发育、分化、存活[7]。本实验发现与假手术组对比，VD大鼠海马组织中cAMP含量、PKAc蛋白表达和CREB结合活性降低，表明cAMP-PKA-CREB信号通路弱化参与了VD的发生和发展。VD大鼠海马神经细胞内钙过高，一则抑制AC的活性，二则激活cAMP特异性磷酸二酯酶 (phosphodiesterase,PDE，能分解cAMP)，导致细胞内cAMP水平降低，PKA活化减少，进而影响CREB调节的转录，妨碍学习和记忆的形成[8]。

Figure 1. The comparision of PKAc protein expression in rat hippocampus of each group±s.n=6.**Plt;0.01 vs sham operation group; ##Plt;0.01 vs VD model group.

Figure 2. The comparision of CREB DNA-bingding activity in rat hippocampus of each group. ±s.n=6. **Plt;0.01 vs sham operation group.##Plt;0.01 vs VD model group.1:VD model group;2:nimodipine treatment group;3:BYHWT treatment group; 4:sham operation group.

从中医角度来看，VD的病机为“气虚血瘀”。补阳还五汤中重用黄芪补气，使气旺以促血行，祛瘀而不伤气，并配以归尾活血祛瘀而不伤血；川芎、赤芍、桃仁、红花助归尾活血祛瘀；地龙通经活络[9]。反复慢性脑缺血再灌注损伤是VD的病理生理学基础。实验研究发现，补阳还五汤抗脑缺血再灌注损伤的作用机理与改善血流动力学、抑止自由基产生、灭活自由基、抑制兴奋性氨基酸释放、防止钙超载、降低NO与NOS活性、减少炎症细胞聚集、保护血脑屏障和抑制细胞凋亡有关[10]。本实验应用补阳还五汤后，可增加海马cAMP含量、PKAc蛋白表达和CREB结合活性，结合前期行为学和形态学实验结果[11]，可见补阳还五汤可增强cAMP-PKA-CREB信号通路作用，从而改善VD大鼠的学习和记忆能力，减轻神经元损伤。Takeo等[12]发现一种记忆增强剂(奈非西坦)可改善持续性脑缺血大鼠的空间记忆功能，而这种记忆功能的改善正是通过PKA信号转导通路，提高了顶叶皮质和海马的PKA和磷酸化CREB的含量。

目前关于cAMP-PKA-CREB信号通路在血管性痴呆中的其它作用也有相关报道。如该通路在大鼠脑缺血再灌注后轴突生长和诱导中起重要作用[13]； 该通路在神经系统缺血缺氧性损伤后提供神经保护信号：cAMP通过CREB直接或间接激活相关基因(如IEGs)的转录，进而表达c-Fos、Jun-B、Jun-D、Bcl-2以及某些神经营养因子，使部分细胞在缺血性损伤后得以存活[14]。以上事实提示增强cAMP-PKA-CREB信号转导通路可能成为血管性认知障碍患者潜在的治疗措施。

[1] Hinoi E,Balcar VJ,Kuramoto N,et al.Nuclear transcription factors in the hippocampus[J].Progr Neurobiol,2002,68(2):145-165.

[2] Ullian EM,Sapperstein SK, Christopherson KS,et al.Control of synapse number by glia[J].Science, 2001,291(5504): 657-661.

[3] Schmidt-Kastner R,Paschen W,Ophoff BG,et al.A modified four-vessel occlusion model for inducing in complete forebrain ischemia in rats[J].Stroke,1989,20(7):938-946.

[4] Bernabeu R,Schmitz P,Faillace MP,et al.Hippocampal cGMP and cAMP are differentially involved in memory processing of inhibitory avoidance learning[J].Neuroreport,1996,7(2)：585-588.

[5] Huang YY,Zakharenko SS, Schoch S, et al. Genetic evidence for a protein-kinase-A-mediated presynaptic component in NMDA-receptor-dependent forms of long-term synaptic potentiation[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(26):9365-9370.

[6] Nie T, McDonough CB, Huang T,et al. Genetic disruption of protein kinase A anchoring reveals a role for compartmentalized kinase signaling in theta-burst long-term potentiation and spatial memory[J]. J Neurosci,2007,27(38):10278-10288.

[7] Moncada D, Viola H. Phosphorylation state of CREB in the rat hippocampus: a molecular switch between spatial novelty and spatial familiarity[J].Neurobiol Learn Mem,2006,86(1):9-18.

[8] 吕佩源,尹 显,王伟斌，等.石杉碱甲对血管性痴呆小鼠海马神经细胞[Ca2+]i及钙调蛋白、蛋白激酶Ⅱ信使核糖核酸表达的影响[J].中国新药与临床杂志,2004,23(2):73-76.

[9] 金洋淑.补阳还五汤对缺血性中风应用的探识[J].实 用 中 医 内 科 杂 志,2006,20(3):219-220.

[10]赖 真，蔡智刚.补阳还五汤抗脑缺血再灌注损伤作用机制的研究进展[J].中国中医急症，2005,14(9):887-888.

[11]唐敬龙，高维娟，李玉明，等.补阳还五汤对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马组织ERK2与CAMKⅡβ蛋白表达的影响[J]. 中国病理生理杂志,2010,26(9):1722-1727.

[12]Takeo S,Niimura M. A possible mechanism for improvement by a cognition-enhancer nefiracetam of spatial memory function and cAMP-mediated signal transduction system in sustained cerebral ischemia in rats[J].Br J Pharmacol, 2003,138(4):642-654.

[13]常丽英,许予明,张苏明，等.环磷酸腺苷-蛋白酶A信号系统参与神经生长因子促进脑缺血再灌注大鼠轴突再生[J].中华老年心脑血管病杂志,2006, 8(5): 350-353.

[14]姜 勇,罗深秋.细胞信号转导的分子基础与功能调控[M].第1版.北京：科学出版社,2005.56-105.

EffectofconcentrateddecoctionofChineseherbalcompoundBuyanghuanwutangoncAMP-PKA-CREBsignalingpathwayinhippocampusofratswithvasculardementia

ZHANG Hong-bo, GAO Wei-juan, QIAN Tao, TANG Jing-long, LI Jun

(DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China.E-mail:gwj6088@163.com)

AIM: To evaluate the role of concentrated decoction of Chinese herbal compound Buyanghuanwutang (BYHWT) in cyclic adenosine monophosphate(cAMP)-protein kinase A(PKA)-cAMP response element-binding protein(CREB) signaling pathway in hippocampus of rats with vascular dementia (VD).METHODSThe rats were randomly divided into sham operation group (sham-operated rats treated with normal saline), VD model group (VD rats treated with normal saline), BYHWT treatment group (VD rats treated with BYHWT) and nimodipment treating group (VD rats treated with nimodipine). The rat model of VD was build by the method of four-vessel occlusion. The rats in all 4 groups were administered with the corresponding reagents for successive 30 days. The content of cAMP was measured by radioimmunoassay. The expression of PKA catalytic subunit (PKAc) was observed by Western blotting. The changes of DNA-binding activity of CREB in rat hippocampus were detected by electrophoretic mobility shift assay.RESULTSThe content of cAMP, the expression of PKAc and the DNA-bingding activity of CREB in the hippocampus of VD rats were lower than those in the hippocampus of sham-operated rats (Plt;0.01). The above indexes in both nimodipine treatment group and BYHWT treatment group were definitely higher than those in VD model group (Plt;0.01).CONCLUSIONBYHWT increases the content of cAMP, the expression of PKAc and the DNA-binding activity of CREB in VD rat hippocampus, thus strengthening the cAMP-PKA-CREB signaling pathway.

Buyanghuanwutang; Dementia,vascular; cAMP; Protein kinase A; cAMP response element-binding protein

1000-4718(2011)04-0718-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.018

2010-09-23

2011-01-27

国家自然科学基金资助项目(No. 30772873)；河北省卫生厅医学科研重点课题(No.20090582)

△通讯作者 Tel：0314-2291141；E-mail：gwj6088@163.com