房颤患者血清对心肌成纤维细胞趋化运动的影响*

段卡丹, 李裕舒△， 史晓婧

(1华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管病研究所, 湖北 武汉 430022; 2偃师市人民医院， 河南 偃师 471900)

房颤患者血清对心肌成纤维细胞趋化运动的影响*

段卡丹1, 李裕舒1△， 史晓婧2

(1华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管病研究所, 湖北 武汉 430022;2偃师市人民医院， 河南 偃师 471900)

目的研究心肌成纤维细胞的运动特性，以及房颤与非房颤患者血清对成纤维细胞趋化运动诱导能力的差异。方法用胰酶和胶原酶消化、差速贴壁法培养新生SD大鼠的心肌成纤维细胞，取3-4代采用Transwell装置检测房颤组血清与非房颤组血清诱导成纤维细胞运动的能力差异。结果在各组血清的趋化诱导作用下，与对照组相比，迁移至下室的细胞数明显增多。其中持续性房颤组最多，非房颤房性心律失常组明显高于阵发性房颤组，对照组细胞数最少，各组比较均具有显著差异。Logistic回归分析表明，迁移至滤膜下的细胞数与左房直径以及房颤有相关性。结论(1)各组血清的趋化诱导能力高于对照组，不同组间的差异说明心房纤维化是一个慢性、隐匿、迁延的过程。以修复为目的的成纤维细胞迁移浸润数量间接反映了心肌损伤的存在、范围和程度。(2)迁移浸润的细胞数变化先于左房直径变化，提示房颤和左房直径增大的正相关关系可能并非直接的因果关系，心房肌损伤后的纤维化可能参与其中。

心房颤动; 心肌成纤维细胞; 趋化作用

心房纤颤(atrial fibrillation，AF)简称房颤，是临床上常见的心律失常，成人中发生率接近2%，并且它随着年龄的增长而增加，超过65岁的人群中发病率为5.9%[1]。房颤因回心血量减少而诱发或加重心功能衰竭、因长时间过速的心室率致心肌病、因心房同步收缩消失而致左心房血栓形成导致血栓栓塞。研究显示，房颤患者心血管疾病的病死率增加2倍，脑卒中的发病率增加4倍；房颤是心血管事件发生率和死亡率增加的主要原因[2]。多项研究[3-6]显示房颤患病率的增长与冠心病、高血压、慢性心力衰竭、风心病等慢性病发病率的增长相关，Smit等[7]心脏研究显示：高龄、高血压、冠心病、心衰和瓣膜病都是与房颤相关的独立危险因素。

房颤的发生机制仍不十分明确，既往房颤的研究主要集中在心肌细胞本身的变化上，对成纤维细胞的作用知之甚少。随着对心房组织进一步的研究发现，心房纤维化是一个与房颤密切相关的组织重构现象，它是心肌损伤和修复失衡的结果。心房成纤维细胞是心肌细胞外基质胶原合成和聚集的主要细胞类型，心房纤维化时，心肌成纤维细胞不仅数量增多，其合成和分泌胶原也会明显增多。成纤维细胞在心肌纤维化过程中除胶原蛋白产物产生和播散作用外，是否存在迁移运动过程以及对心房肌间的结构重构产生影响迄今尚未见报道。本文旨在研究房颤与非房颤组血清对成纤维细胞迁移运动的诱导能力，为成纤维细胞在房颤过程中迁移运动对心房肌的分割和纤维化作用寻求实验室依据。

材 料 和 方 法

1材料

DMEM高糖干粉培养基、新生牛血清、胰酶-EDTA(Gibco)，胶原酶B型(Roche)，胰蛋白酶1∶250(Americo)，Transwell购自Corning，Gimsa染剂购自南京建成公司,新生SD大鼠(武汉大学动物中心)。

2方法

2.1病例选择 实验对象共分为4组。其中房性心律失常病人共56例，选自2009年6月-2010年3月在武汉协和医院住院期间被诊断为房性心律失常的患者。其中非房颤房性心律失常组(non-AF atrial arrhythmia,AA)共18例；阵发性房颤组(paroxysmal atrial fibrillation，Paro-AF)(发作时间≤7 d)共19例；持续性房颤组(persistent atrial fibrillation，per-AF)(发作时间gt;7 d)共20例；对照组为年龄、性别和相关疾病匹配的窦性心律者共16例。患者均经病史、体格检查、心电图、心脏彩超、动态心电图等诊断证实。近3个月内有心梗病史、急性冠脉综合征、心肌病或心肌炎；近2个月内有手术外伤史或感染史；肿瘤及免疫系统疾病；肝、肾功能不全患者；近期正在服用抗炎药物或激素替代治疗患者等排除在外。各组年龄、性别、相关疾病无显著差异，见表1。

2.2标本采集 入选患者均晨起空腹，静卧30 min后，采肘静脉血4 mL，室温下充分凝固后，3 000 r/min离心20 min，离心后取上清，-60℃保存备用。

2.3成纤维细胞培养 无菌条件下开胸取出SD大鼠乳鼠(1-3 d)心脏，立即置入预冷的PBS中，洗净残血，剪成约1 mm×1 mm×1 mm碎片，弃去PBS，加入0.1%胶原酶B、0.25%胰酶及PBS混合液，于37 ℃水浴中分次振荡消化，第1次消化10 min，弃上清，以后每次5 min，收集上清用等体积20%新生牛血清的培养基终止消化，1 000 r/min离心10 min后所得的细胞用20%新生牛血清培养基制成细胞悬液，种于50 mL培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养75 min后，弃去上清获得成纤维细胞。取3-4代用于实验。

表1 临床资料

2.4细胞趋化实验 采用Transwell法，Transwell小室滤膜为孔径8 μm的聚碳酸酯微孔滤膜。取第3或4 代心肌成纤维细胞， 0.1%BSA饥饿过夜，消化重悬调整细胞密度为2×108cells/L，取0.1mL加入上室；下室中分别加入0.6 mL浓度为20%的病人血清作为化学趋化物，置于37℃、5%CO2培养箱中，18 h后取出滤膜，4%多聚甲醛固定10 min，PBS冲洗，棉签拭去上室表面内残存细胞，Giemsa染色。显微镜下随机取5个视野(×200)细胞数取平均值(个/HP)，每组血清均重复3次。

3统计学处理

结 果

1各组血清对心肌成纤维细胞趋化运动及细胞数影响

在各组血清的趋化作用下，持续性及阵发性房颤组、非房颤房性心律失常组迁移至下室的细胞数分别为105.00±10.36、68.00±12.82、89.00±7.09，而对照组为60.00±11.87，4组间有明显差异(Plt;0.01)。其中持续性房颤组血清对成纤维细胞的趋化作用最明显，非房颤房性心律失常组较阵发性房颤组明显增加，对照组最弱，各组相比均有显著差异(Plt;0.05),见表2、图1；在房颤组(持续性和阵发性)血清的诱导下，迁移至滤膜外的细胞数为86.00±22.33，与非房颤房性心律失常组和对照组比较，3组间有明显差异(Plt;0.01)，房颤组与对照组相比差异明显(Plt;0.05)，而房颤组与非房颤房性心律失常组比较两者差异无显著。

Figure 1. The change of cardiac fibroblast chemotaxis in each group (Giemsa staining)

2各组左房直径

患者左房直径有明显差异，其中持续性房颤组左房直径为(5.40±0.63)cm，阵发性房颤组、非房颤房性心律失常组、对照组分别为(4.70±0.79)cm、(3.80±0.56)cm、(4.00±0.76)cm。持续性房颤组左房最大，阵发性房颤组次之，与其它各组比较显著差异(Plt;0.05)；非房颤房性心律失常组与对照组比较无显著差异，见表2。房颤组(持续性和阵发性)左房直径为(5.10±0.60)cm，与其余两组比较，差异均具有显著(Plt;0.05)。

表2 各组左房直径及细胞数

3多元Logistic回归分析

将性别、高血压、心衰、瓣膜病、冠心病、糖尿病、房颤以及连续型变量(年龄、左房直径、细胞数)等级化后纳入Logistic模型，其中房颤(OR=0.260，95%CI：0.069-0.990，Plt;0.05)、左房直径(OR=0.565，95%CI：0.323-0.987，Plt;0.05)与细胞数有相关性。

讨 论

我们的前期研究结果证实了房颤血清具有诱导成纤维细胞在试验培养过程中增殖的重要作用[8]，本实验再次显示房颤血清对成纤维细胞还有诱导迁移作用。房颤和心房纤维化相伴行的现象已为公认病理结果。心肌成纤维细胞是构成心脏的主要细胞类型，占心肌细胞数量的70%[9]。有证据显示成纤维细胞在心脏的手术修复和心脏的重构中起着改变电生理和炎症反应等方面重要作用[10]。成纤维细胞无论从邻近存活心肌转化而成，抑或因纤维细胞激活、迁移、浸润而至，均具有在坏死区域行使修复的作用，细胞外基质产生的恰当与否则成为纤维化程度的主要差异。因而，成纤维细胞的迁移和增殖是心肌纤维化的关键环节。本研究各组迁移的成纤维细胞数差异说明各组血清对心肌成纤维细胞的诱导作用具有差异，提示诱导迁移过程不是简单的单次诱导行为，而是一个反复、缓慢、迁延、隐匿的过程，是炎症反应的一部分。

传统观点认为房颤受心房大小的影响，甚至有研究认为左房直径已成为房颤的重要预测因子[11-15]。本研究结果中房颤和左房大小的临床统计均支持房颤与左心房大小有相关性，但本实验中迁徙细胞数统计结果提示非房颤房性心律失常组较阵发性房颤组明显增加，与左房直径却呈负相关关系，提示细胞数的变化明显先于左房直径的变化，在心房直径尚未发生改变前，损伤与修复就已经存在了，间接表明房颤和左心房增大的变化可能均为心肌损伤变化的结果。所以，多元Logistic 回归分析显示迁移的细胞数与左房直径呈正相关关系可能受到心肌损伤因素的影响，两者间可能不是直接因果关系。迁移浸润的细胞数是间接反映心肌损伤存在的一项指标，并与损伤的程度和范围密切相关。非房颤房性心律失常组与对照组比较，心房大小无明显差异，其血清对成纤维细胞趋化能力的诱导作用明显增高(Plt;0.05)，表明此时心肌损伤已经存在，有明显的细胞浸润，心肌修复已在进行；阵发性房颤已有左房形态结构改变，但细胞数介于非房颤房性心律失常组和对照组之间，说明此阶段虽有损伤存在，但处于损伤的相对静止期，此阶段是一个可逆的稳定阶段，若得到恰当的干预是可逆或终止的，该结果成为阵发性房颤值得射频消融的实验室依据之一。持续性房颤组迁移细胞最多，预示损伤和修复的范围广，纤维化进程加快，纤维化过程处于较高活动水平。本实验中做了2例永久性房颤患者，迁移的细胞数明显低于对照组，说明心房肌损伤修复已处于终末阶段，进一步的心肌损伤和纤维修复的空间甚微，不足以成有效诱导纤维细胞。尽管该组病例数很少，却给我们研究房颤纤维化进程提供了线索。非房颤房性心律失常组迁移细胞数与不同房颤类型之间的差异。充分说明纤维化过程迁延或反复进行。在一定时期内，纤维化可缓慢持续存在，也可间歇发生。

本研究纳入的房性心律失常包括房性早搏、各种不同类型的房速、心房扑动等一些容易被忽视但值得关注的类型。结果同样显示该类病人血清已经具有诱导成纤维细胞迁移的作用，提示这些患者已经存在隐袭的心肌损伤和修复过程，以及纤维化的形成。从另一个角度提示自然发生的非房颤房性心律失常可以向阵发性房颤发展最终演变成为持续性房颤的缓慢过程，及早发现那些心肌损伤和对其进行有针对性的干预尤为重要。

心脏重构中成纤维细胞是起决定作用的细胞。纤维化结果影响着心肌细胞的电生理协调和机械收缩功能，影响着组织的粘黏、骨架运动和伸缩功能。进一步观察诱导成纤维细胞运动行为的因素有利于揭示心肌纤维化的细胞因子机制，为房颤心房纤维化的治疗提供新的途径。而对成纤维细胞的运动机制探讨和调控将会成为预防房颤的一个重要环节。

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Effectsofserumfrompatientswithatrialfibrillationonchemotaxisofcardiacfibroblasts

DUAN Ka-dan1, LI Yu-shu1, SHI Xiao-jing2

(1InstituteofCardiovascularDiseases,UnionHospitalofTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China;2YanshiMunicipalPeople’sHospital,Yanshi471900,China.E-mail:Lyshu1@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effects of the serum from the patients with atrial fibrillation (AF) on the chemotaxis of rat cardiac fibroblasts.METHODSCardiac fibroblasts were isolated from the ventricles of neonatal Sprague-Dawley rats and primarily cultured with digestion and differential adhesion. The cells in 3 to 4 passages were used for Transwell chamber assay to determine the chemotatic effects of the sera.RESULTSCompared with control group, the cells that migrated through the polycarbonate membrane were obviously increased in AF group. The strongest chemotaxis was induced by the serum from the patients with persistent atrial fibrillation(pers-AF).The number of migrated cells in non-AF atrial arrhythmia(AA) group was higher than that in paroxysmal atrial fibrillation(paro-AF) group, and that in control group was the lowest. The results of multiple Logistic regression analysis showed that the migrated cells were related to AF and left atrial diameter.CONCLUSIONThe chemotactic effect of AF serum is obviously higher than that of control serum. The differences of AF sera among groups show that myocardial fibrosis is a chronic, insidious and delayed process. The migration and infiltration of cardiac fibroblasts indirectly reflect the presence, severity and extent of the myocardial damage. The changes of migrated cells precede the changes of left atrial diameter, indicating that the cause of fibrosis is more important, and the positive correlation between AF and left atrial diameter may not be the direct causality.

Atrial fibrillation; Cardiac fibroblasts; Chemotaxis

1000-4718(2011)04-0662-04

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.008

2010-10-22

2011-02-18

湖北省科技厅基金资助项目(No.2009CDB070)

△通讯作者 Tel：027-85726423;E-mail:Lyshu1@yahoo.com.cn