菜籽粕混菌固态发酵制备多肽饲料的研究

顾 斌 马海乐,2 刘 斌

(江苏大学食品与生物工程学院1,镇江 212013)

(江苏省农产品生物加工与分离工程技术研究中心2,镇江 212013)

菜籽粕混菌固态发酵制备多肽饲料的研究

顾 斌1马海乐1,2刘 斌1

(江苏大学食品与生物工程学院1,镇江 212013)

(江苏省农产品生物加工与分离工程技术研究中心2,镇江 212013)

以菜籽粕为原料,以发酵产物中真蛋白质量分数、多肽得率和硫苷含量为评价指标,通过米曲霉、白地霉、热带假丝酵母、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的单菌及混菌发酵,进行最佳发酵菌种组合的研究;通过最佳混菌的单因素试验,研究在培养基中添加无机盐 (CaCl2、K2HPO4、MgSO4、FeSO4和 CuSO4)、氮源[CO(NH2)2、(NH4)2SO4、KNO3、NH4Cl和 NH4HCO3)]、辅料 (麸皮、玉米粉和米糠 )和料水比对发酵效果的影响。以发酵产物的多肽得率为评价指标,通过正交试验优化培养基的组成。结果表明,白地霉和枯草芽孢杆菌为最佳发酵混合菌种;培养基中 CaCl2是最好的无机盐,NH4Cl是最好的无机氮源,3种辅料的添加对发酵效果均没有显著的改善作用;最优培养基组成是:CaCl20.1%、NH4Cl 1.5%、料水比 1∶1.2,使用最优培养基进行混菌发酵,多肽得率高达 12.81%。

菜籽粕 固态发酵 混菌 多肽 硫苷

我国年产菜籽饼粕约 769万吨,菜籽饼粕含有35%～45%蛋白质[1]。因此菜籽粕应当成为很好的蛋白饲料原料,但实际情况并未如此,主要原因有两个:一是非双低菜籽的粕中硫苷等抗营养因子含量较高;二是菜籽粕中蛋白的消化吸收率较低[2],尤其是压榨制油工艺得到的饼粕。目前,对菜籽粕的研究主要集中在脱毒方面,而对生产富含更容易被动物消化吸收的多肽饲料研究不多[3]。

多肽饲料就是通过化学或生物方法将本来不适合动物利用的蛋白原料分解,制成的含有大量多肽的饲料产品[4]。目前生产多肽饲料的方法主要有酸解法、酶解法和微生物发酵法[4]。

与其他两种方法相比,微生物发酵法不但能将大分子植物蛋白降解成多肽,而且能提高粗蛋白含量和降解硫苷等抗营养因子。目前国内外同类研究存在的问题是,在提高蛋白含量、降硫苷、降解大分子植物蛋白三个方面不能很好的兼顾,因此本试验利用多菌种发酵菜籽粕生产多肽蛋白饲料,筛选出在降低硫苷含量、提高蛋白质含量、降解大分子蛋白质三个方面都表现较优的菌种,在此基础上合理组合混菌发酵,筛选出综合表现较好的菌种组合,再以多肽得率为目标对发酵培养基的组成进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

菜籽粕 (真蛋白质量分数 22%,硫苷含量 64.83 μmol/g,含水量 4.47%):丹阳市正大油脂有限公司提供。麸皮、米糠、玉米粉:市售。

1.1.2 菌种

白地霉 (Geotrichum candidum2.1132)、米曲霉 1(Aspergillus oryzae3.4383)、米曲霉 2(Aspergillus oryzae3.5232):中国微生物菌种保藏中心;热带假丝酵母 (Candida tropicalisC3161)、枯草芽孢杆菌 (B a2 cillus subtilusM5112):江苏大学三环生物工程成套设备有限公司;酿酒酵母 (Saccharom yces cerevisiae):本实验室保藏。

1.1.3 培养基

种子培养基;麦芽汁培养基 (培养酵母菌、白地霉)、牛肉膏蛋白胨培养基 (培养枯草芽孢杆菌)、Czapek’s培养基 (培养米曲霉 )。

菌种筛选培养基:在 250 mL三角瓶中加入菜籽粕 20 g、麸皮 2 g、尿素 0.6 g、20 mL水 ,搅拌均匀 ,121℃高压灭菌 15 min后备用。

基础发酵培养基:在 250 mL三角瓶中加入菜籽粕 20 g,20 mL水搅拌均匀,121℃高压灭菌 15 min后备用。

固态发酵培养基:在 250 mL三角瓶中加入 20 g菜籽粕,根据试验设计添加无机氮、金属离子、辅料和水,搅拌均匀,121℃高压灭菌后备用。

1.2 试验方法

1.2.1 菜籽粕固态发酵流程

1.2.2 单菌发酵试验

将米曲霉、白地霉、热带假丝酵母、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌分别在液体培养基上活化后,按 10%接种量分别接种到菌种筛选培养基中,在 30℃培养箱中连续培养 3 d。发酵产品在 60℃烘干 24 h,测定其真蛋白质量分数、硫苷含量、多肽得率。

1.2.3 混菌发酵试验

根据单菌发酵试验,选择真蛋白质量分数最高、硫苷含量最低和多肽得率最高的菌种,合理组合,混菌发酵 (菌种接入不分先后,总接种量仍为 10%),在30℃培养箱中连续培养 3 d。发酵产品在 60℃下烘干 24 h,测定其真蛋白质量分数、硫苷含量、多肽得率。

1.2.4 培养基成分的优化

采用单因素试验分别考察无机盐、氮源、辅料种类及添加量、培养基料水比对混菌发酵菜籽粕综合效果的影响。考察单一因素时,其他因素分别是料水比 (g/mL)1∶1,不添加氮源、无机盐和辅料。根据单因素试验结果,以多肽得率为指标,通过正交试验对发酵培养基进行优化。

1.3 检测方法

1.3.1 真蛋白质量分数的测定

[5]测定。

1.3.2 硫苷含量测定

氯化钯分光光度法[6]。

1.3.3 多肽得率测定

参考文献[7]测定。用标准牛血清蛋白溶液测定得到的多肽浓度标准曲线是:

y=0.075 8x+0.001 8

式中:y为吸光值;x为多肽质量浓度 /mg/mL。多肽得率按照下式计算:

式中:V为待测液体积/mL;m为样品总质量/mg;U为多肽得率/%。

2 结果与讨论

2.1 菌株筛选

2.1.1 单菌株发酵试验

米曲霉 1(Ao1)、米曲霉 2(Ao2)、白地霉 (Gc)、热带假丝酵母 (Ct)、酿酒酵母 (Sc)和枯草芽孢杆菌(Bs)的单菌发酵菜籽粕试验结果如表 1所示。

表 1 不同微生物单菌发酵对硫苷、蛋白、多肽得率的影响

由表 1可知米曲霉 1、枯草芽孢杆菌具有较高的硫苷降解能力,米曲霉 1发酵硫苷降解率达到66.8%。米曲霉 1发酵后真蛋白质含量反而减少,这可能是因为米曲霉把真蛋白降解成了非蛋白氮。白地霉、酿酒酵母发酵真蛋白质量分数提高显著,白地霉发酵真蛋白质量分数达到 34.8%,与原料相比提高了 12.8%左右。真蛋白质量分数提高主要有两方面的原因:一是菌体利用氮源合成了菌体蛋白;二是菌体发酵后底物减重的“浓缩效应”[8]。枯草芽孢杆菌发酵后多肽得率最高,达到 10.3%。总的来说,单菌发酵在降解硫苷、提高真蛋白质量分数、生产多肽三个方面不能很好的兼顾。

2.1.2 混菌发酵试验

根据单菌株发酵试验结果,选择提高真蛋白质量分数效果较好的白地霉和酿酒酵母,降解硫苷能力最强的米曲霉 1和枯草芽孢杆菌以及生产多肽最多的枯草芽孢杆菌,进行双菌、三菌、四菌混菌发酵,试验结果如表 2。

表 2 不同混菌组合混菌发酵效果

比较表 1和表 2发现,混菌发酵能较大幅度的提高真蛋白质量分数,显著优于单菌发酵。这是因为混菌发酵时多菌体系中微生物生长状况优于单菌发酵体系微生物生长状况,使发酵产物中的菌体数目增多,消耗的碳源、能源物质相应增加,使发酵产物的得率减少,出现了较大的蛋白质“浓缩效应”,最终导致了产物真蛋白质量分数的增加。但是除了白地霉和枯草芽孢杆菌的组合,其余组合多肽得率都没明显增大,硫苷含量没有明显降低,甚至某些组合发酵不如单菌发酵效果,原因可能有两个:一是因为试验保证总接种量不变,每种菌的接种量相对减少,因此影响了发酵的总体效果[9];二是因为菌种之间可能存在拮抗作用。综合考虑,本试验选用白地霉和枯草芽孢杆菌混菌发酵。

2.2 菜籽粕发酵培养基的优化

2.2.1 无机盐选择

向基础培养基中添加 0.1 g的无机盐 CaCl2、K2HPO4、MgSO4、FeSO4和 CuSO4,提供金属离子 ,结果见图 1。以基础发酵培养基发酵试验为对照,添加所有的无机盐都会有利于真蛋白质量分数的提高,但是只有添加 CaCl2才有助于提高硫苷的降解以及多肽得率,这可能是因为 Ca2+是蛋白酶和芥子酶的激活剂。

图 1 不同无机盐对发酵效果的影响

2.2.2 CaCl2添加量对发酵效果的影响

CaCl2添加量对发酵效果的影响如图 3所示。由图 3可以看出,随着 CaCl2添加量的提高,硫苷、真蛋白质量分数变化不明显,多肽得率先升高后降低,可能有两个原因:一是 CaCl2浓度太高反而会抑制蛋白酶的活性;二是盐浓度的提高会改变渗透压,渗透压过高会抑制微生物的生长[10]。

图 2 CaCl2添加量对发酵效果的影响

2.2.3 氮源的选择

在基础发酵培养基中添加 3%的氮源 CO(NH2)2、(NH4)2SO4、KNO3、NH4Cl和 NH4HCO3发酵后 ,结果见图 3。

图 3 不同氮源对发酵效果的影响

由图 3可知,与不添加氮源相比,添加氮源对真蛋白质量分数的影响不显著,这可能是因为菜籽粕中已经有足够的非蛋白氮可转化为蛋白氮。添加NH4Cl可显著提高多肽得率,因此本试验选择添加NH4Cl。这与袁建等[7]研究得到的添加尿素可显著提高多肽得率的结果不一致,其原因还需要今后进一步研究。

2.2.4 NH4Cl添加量对发酵效果的影响

图 4 NH4Cl添加量对发酵效果的影响

NH4Cl添加量对发酵效果的影响见图 4。从图 4可见,随着 NH4Cl添加量的增加,硫苷含量变化不大。添加小于 4.5%的 NH4Cl,真蛋白质量分数与不添加相比都略有提高,但添加量过多反而不利于真蛋白质量分数的提高。多肽得率受 NH4Cl添加量的影响显著,随着添加量的增加先增大后减小,添加3%时含量最高。

2.2.5 辅料的选择

辅料的作用主要是增加发酵基质的碳氮源,使基质的碳氮比更为合理。在基础发酵培养基中分别掺入 10%的麸皮、玉米粉和米糠 3种辅料发酵,发酵结果见图 5。

图 5 不同辅料对发酵效果的影响

从图 5可见,添加不同的辅料,3项指标都没有明显的改善,反而会使指标降低,因此在下面的试验中不添加任何辅料。

2.2.6 料水比对发酵效果的影响

设计料水比 (质量比 )分别为 1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4共 5个水平 ,考察了其对发酵效果的影响,结果如图 6所示。

图 6 料水比对发酵效果的影响

含水量的多少对微生物的生长和代谢能力都有显著影响,含水量过低,造成基质膨胀程度低,物料较干燥,微生物难以生长,产酶量降低;含水量过高,减少了基质内气体体积和气体交换,也不利于菌种的生长。由图 8可见,随着含水量的增加,真蛋白质量分数的变化甚微,硫苷含量在较小的范围内先增后降,多肽得率的变化最为显著。综合考虑三项指标,初始料水比选择 1∶1.2。

2.2.7 正交试验

根据单因素试验结果,选择料水比、CaCl2的添加量和 NH4Cl添加量为影响因素,并分别选取 3个水平,以发酵物料多肽得率为指标,在不考虑交互作用的情况下,进行正交试验。选用 L9(34)正交表,因素水平见表 4,试验结果见表 4。

表 3 正交试验因素及水平

表 4 正交试验结果及计算表

表 5 正交试验方差分析表

根据表 4可知,各因素对多肽得率的影响是CaCl2添加量 >料水比 >NH4Cl添加量。根据表 5方差分析可知,料水比与 CaCl2含量对混菌发酵菜籽粕生产多肽有显著影响,NH4Cl含量对多肽得率影响不显著。因此发酵培养基的最佳条件是 CaCl2添加量 0.1%、料水比 1∶1.2、NH4Cl添加量 1.5%。由于正交表没有该项培养基组成,追加试验结果表明多肽得率达到 12.81%。

3 结论

3.1 单菌发酵试验表明,枯草芽孢杆菌发酵得到的多肽最多,白地霉、热带假丝酵母、酿酒酵母发酵菜籽粕真蛋白质量分数最高,米曲霉 1降解硫苷的能力最强。

3.2 混菌发酵试验表明,混菌发酵与单菌相比更有利于提高蛋白质含量,白地霉和枯草芽孢杆菌组合发酵菜籽粕综合效果最好。

3.3 单因素和正交试验得出,当料水比为 1∶1.2、CaCl2为 0.1%、NH4Cl为 1.5%时,多肽得率达到最大,达到 12.81%。

参考文献

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[2]M K Tripathi,A SMishra.Glucosinolates in animal nutrition:A review[J].Animal Feed Science and Technology,2007,123:1-27

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[4]戚伟赵,树欣.混菌发酵生产富肽蛋白饲料工艺条件的研究[J].饲料工业,2007,28(17):6-9

[5]邱鑫,肖汉乾.菜籽饼粕粗蛋白降解菌的筛选、初步鉴定与发酵条件摸索[J].氨基酸与生物资源,2005,27(1):1-5

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[8]富中菲.酵母单细胞蛋白固态发酵系统中氮素变化的研究[J].吉林农业大学学报,2002,24(1):92-97

[9]邬苏焕,宋兴福.双菌固态发酵处理餐厨垃圾[J].食品与发酵工业,2004,30(5):63-67

[10]Kim I S,Ki m D H.Effect of particle size and sodium ion concentration on anaerrobic thermophilic food waste diges2 tion[J].Water Science Technology,2002,41(3):67-73.

Preparation ofBio-Feedstuffwith Rich Peptides from RapeseedMeal byMixed Solid Fer mentation

Gu Bin1Ma Haile1,2Liu Bin1
(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University1,Zhenjiang 212013)
(Jiangsu Provincial Research Center ofAgricultural ProductsBio-processing and Separation Engineering2,Zhenjiang 212013)

Rapeseed mealwas used to prepare bio-feedstuffwith rich peptide by single ormixed strains solidfer mentation.The used strains includedAspergillus oryzae(Ao),Geotrichum candidum(Gc),Candida tropicalis(Ct),Saccharom yces cerevisiae(Sc)andBacillus subtilus(Bs).Effects of single or mixed strains solid-fer mentation on contents of true protein,peptide and glucosinolate in the fer mentation productwere investigated to search optimal com2 bination of cultures. Taking peptide content as evaluation index,the effects of inorganic salt(such as CaCl2,K2HPO4,MgSO4,FeSO4and CuSO4),nitrogen sources[such as urea CO(NH2)2,(NH4)2SO4,KNO3,NH4Cl and NH4HCO3],accessory(such aswheat bran,corn flour and rice bran)and solid/liquid ratio in the culturemedium on the fer mentation processwere studied by single factor tests,and the composition of culture medium was opti mized by an orthogonal experiment.Results:Gc and Bs is the opti mal fer mentation mixed strains;CaCl2is the best inorganic salt in the culture medium and NH4Cl is the best nitrogen sources.Three kinds of accessory show no remarkable im2 provement on the fer mentation effect.The composition of optimal culture medium is CaCl20.1%,NH4Cl 1.5%and solid/liquid ratio 1∶1.2.The product peptide content of fer mentation with the optimal culture medium reaches 12.81%.

rapeseed meal,solid-state fer mentation,mixed strains,peptide,glucosinolate

S816.4

文章编号:1003-0174(2011)01-0083-05

江苏省科技成果转化专项资金(BA2008100)

2010-01-28

顾斌,男,1985年出生,硕士,食品科学

马海乐,男,1963年出生,教授,博士生导师,降血压肽、饲料