红毛七乙醇提取物和不同极性部位抗氧化活性的研究

但飞君，鄢文芳，褚立军，鲁文艳，蔡正军

（三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北宜昌443002）

红毛七乙醇提取物和不同极性部位抗氧化活性的研究

但飞君，鄢文芳，褚立军，鲁文艳，蔡正军

（三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北宜昌443002）

主要从清除DPPH自由基（DPPH·）、超氧阴离子自由基（）、羟基自由基（·OH）和亚硝酸盐（）四个方面，研究红毛七乙醇提取物和不同极性萃取部位的体外抗氧化活性。结果表明，红毛七乙醇提取物和不同极性部位对DPPH··、·OH、均具有清除能力，其中乙醇提取物、正丁醇与乙酸乙酯中等极性部位抗氧化活性较强，而极性较小的石油醚部位和极性较大的水部位抗氧化作用较弱。

红毛七，乙醇提取物，极性部位，抗氧化活性

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红毛七 采自湖北省宜昌市长阳土家族自治县，经三峡大学生物技术研究中心王玉兵老师鉴定为小檗科红毛七属植物红毛七（Caulophyllum robustum Maxim.）的根；DPPH Sigma公司；盐酸萘乙二胺 日本东京化工业株式会；其余试剂 均为国产分析纯。

AL204电子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；N-1001旋转蒸发仪 爱朗仪器（上海）有限公司；S-3100紫外可见分光光度计 SCINCO公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精密实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 干燥红毛七粉碎过60目筛，得原药材粉末。以95%乙醇为溶剂，加热回流反复提取，减压浓缩得乙醇总提物（CR）3.6kg。总提物以1∶1悬浮于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液经减压浓缩，即得石油醚部位浸膏（CRP）50.3g、乙酸乙酯部位浸膏（CRE）33.2g、正丁醇部位浸膏（CRB）489.4g、水溶液部位浸膏（CRW）350.2g。

1.2.2 DPPH·清除能力的测定［7-8］精确称取15.8mg DPPH，溶于100mL无水乙醇，配制成0.4mmol·L-1的DPPH母液。依次精确量取0.05、0.25、0.50、0.75、1.00mL的DPPH母液，稀释至2.00mL，在517nm下测其吸光度，得标准曲线：Y=1.233X-0.05228，R= 0.99918。

将1.0mL红毛七乙醇提取物、萃取部位不同浓度的样品溶液与1.0mL 0.15mmol·L-1的DPPH溶液加入同一试管中，摇匀，放置30min后用溶剂作参比，测定其吸光度Ai，同时测定1.0mL 0.15mmol·L-1的DPPH溶液与1.0mL溶剂混合后的吸光度A0，以及1.0mL红毛七乙醇提取物、萃取部位不同浓度的样品溶液与1.0mL溶剂混合后的吸光度Aj。按照下式计算清除率，清除率越大，抗氧化能力越强。

式中：A0：未加抗氧剂时溶液的吸光度；Ai：加抗氧剂后溶液的吸光度；Aj：样品在测定波长的吸光度。

1.2.3 超氧阴离子自由基清除能力的测定［9-10］取4.5mL Tris-HCl缓冲液（50mmol/L，pH为8.2），于20℃水浴中保温20min，分别加入1.0mL不同浓度的乙醇提取物和不同极性萃取部位溶液以及0.4mL的邻苯三酚溶液（25mmol·L-1），混匀后，于25℃水浴中反应5min，加入1.0mL HCl溶液（8mol·L-1）终止反应，在420nm处测定吸光度Ai；空白以蒸馏水代替样品液，测定吸光度A0；以蒸馏水代替显色剂测定样品本身吸光度Aj。按下式计算清除率：

式中：A0：空白对照液的吸光度；Ai：样品组的吸光度；Aj：样品溶液吸光度。

1.2.4 羟基自由基清除能力的测定［11］在试管中加入2.0mL pH=7.4的磷酸盐缓冲液和1.0mL 1.5mmol·L-1的邻二氮菲溶液，混匀，加入1.0mL 1.5mmol·L-1FeSO4溶液，立即混匀。加入1.0mL一定浓度的样品溶液，混匀，加入0.02%的H2O21.0mL，补充体积至8.0mL，37℃保温1h。在510nm处测定吸光度（此为损伤管吸光度）。同时做样品空白实验，另做损伤管和未损伤管，其中损伤管中加入0.02%H2O21.0mL，未损伤管不加H2O2，最后补充各管体积至8.0mL。于37℃下保温1h，测在510nm下的吸光度，重复两次，计算其平均值。按下式计算清除率：

式中：A0：未损伤管的吸光度；A1：损伤管的吸光度；A2：加样品液并扣除样品空白后的吸光度。

1.2.5 亚硝酸盐清除能力的测定［12-13］精确量取亚硝酸钠标准液（5μg·mL-1）0.00、0.20、0.40、0.60、 0.80、1.00mL，分别置于10mL具塞刻度试管中。各加入1.0mL 0.4%的对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置5min，加入0.5mL 0.2%的盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，在538nm下测定吸光值，得标准曲线：Y=0.72478X+0.01348，R=0.99986。

准确称取5μg·mL-1的NaNO2标准溶液两份各1.0mL，分别置于25mL比色管中，其中一份加入一定量的待测样品溶液，在37℃恒温水浴中反应30min，另一份作空白。取出后两份均立即加入1.0mL 0.4%的对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置5min后加入0.5mL 0.2%的盐酸萘乙二胺溶液，加水至10mL，混匀，静置15min，以不加NaNO2的样品溶液的试剂为空白，于538nm处测定吸光值，分别为A1、A2。亚硝酸盐的清除率按下式计算：

式中：A1：加待测样品测定的吸光度；A2：未加待测样品测定的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 红毛七乙醇提取物和不同极性部位对DPPH·的清除作用

DPPH·是一种稳定的自由基，其在可见光区有特征吸收，比色测定简便、快捷。自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，且颜色变浅的程度与配对电子数是成剂量关系的，因此可用于天然抗氧化剂的筛选。本实验通过检测自由基DPPH·的清除率，观察红毛七乙醇提取物和不同极性萃取部位在体外对DPPH·有无清除作用，结果如图1所示。

图1 红毛七乙醇提取物及不同极性部位对DPPH·的清除作用

由图1可知，在测定浓度范围内，样品对DPPH自由基都具有一定的清除能力，对DPPH自由基的清除率总体趋势是随着浓度的增加而提高，但当浓度增加到一定值后，DPPH·清除率随浓度增大不再明显提高，甚至有所下降。其中石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位对 DPPH·的最大清除率分别为52.3%、72.4%、79.0%。乙醇提取物5.0mg·mL-1对DPPH·的清除率达91.4%，正丁醇部位20.0mg·mL-1对DPPH·的清除率达93.4%。正丁醇部位的清除DPPH自由基的作用最强，说明在正丁醇部位中清除DPPH自由基的物质的活性可能最高或含量最高。从实验过程和实验结果分析，当样品浓度增加到一定值时清除率反而有所下降，主要是样品颜色加深和溶解性问题，使得空白吸光度值较大，导致所得结果的偏差。

2.2 红毛七乙醇提取物和不同极性部位对超氧阴离子自由基的清除作用

图2 红毛七乙醇提取物及不同极性部位对·的清除作用

2.3 红毛七乙醇提取物和不同极性部位对羟基自由基的清除作用

羟基自由基（·OH）是化学性质活泼的一种活性氧，也是目前已知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，几乎能与所有的生物大分子发生反应。本实验以邻二氮菲-Fe2+为指示剂，采用比色法测定Fenton反应体系产生的·OH，评价样品对·OH的清除作用，结果如图3所示。

图3 红毛七乙醇提取物及不同极性部位对·OH的清除作用

由图3可知，在测定浓度范围内，样品对·OH都具有一定的清除能力。乙醇提取物、石油醚部位、正丁醇部位对·OH的清除率总体趋势是随着浓度的增加而提高，并呈一定的剂量依赖关系，而乙酸乙酯部位浓度增加到一定值后，·OH清除率随浓度增大不再明显提高甚至有所下降。石油醚部位对·OH具有一定清除能力，最大清除率达52.4%，而水部位对·OH的清除能力较弱。乙醇提取物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位作用最明显。乙醇提取物、正丁醇部位40.0mg·mL-1对·OH的清除率分别达85.5%和79.3%，乙酸乙酯部位10.0mg·mL-1对·OH的清除率达78.2%。乙酸乙酯、正丁醇部位的清除·OH的作用强，说明在乙酸乙酯部位、正丁醇部位中清除·OH的物质的活性可能较高或含量高。实验过程中当样品因浓度较高或极性较小出现溶解性问题时，虽然颜色变化明显但通过吸光度测定后计算结果却显示活性不好。

亚硝酸盐与仲胺在人体中易合成强致癌物质亚硝胺，亚硝胺能引起人体和动物的肝脏等多种器官的恶性肿瘤，因此在体内外清除亚硝酸盐以阻断亚硝胺的合成是防治癌症的有效途径之一。本实验通过检测对的清除率，观察红毛七乙醇提取物的不同极性部位在体外对有无清除作用，结果如图4所示。

图4 红毛七乙醇提取物及不同极性部位对的清除作用

3 结论

实验对红毛七95%乙醇提取物和不同极性萃取部位的体外抗氧化研究结果表明：乙醇提取物和不同极性部位均具有抗氧化作用，其中以正丁醇与乙酸乙酯中等极性部位活性较强，而极性较小的石油醚部位和极性较大的水部位抗氧化作用较弱，这提示乙酸乙酯相和正丁醇相是其主要活性部位。另外在不同的自由基产生体系中，提取物和不同极性部位抗氧化活性强弱不尽相同。从DPPH·清除能力的测定中可知，最大清除率的顺序为：正丁醇部位＞乙醇提取物＞水部位＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位；对·的最大清除率的顺序为：乙酸乙酯部位＞乙醇提取物＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位；对·OH的最大清除率的顺序为：乙醇提取物＞正丁醇部位＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞水部位；对的最大清除率的顺序为：正丁醇部位＞乙酸乙酯部位＞水部位＞乙醇提取物。相同极性部位的提取物在不同的自由基体系中，其清除能力也不同。就正丁醇部位而言，对DPPH·的最大清除率为93.4%，对·的最大清除率达64.7%，对·OH的清除率达79.3%，对的最大清除率为80.6%。这可能与红毛七提取物的不同极性部位中所含抗氧化成分的种类和结构有关，故在不同的抗氧化体系中，不同极性部位的抗氧化作用不同。

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Study on antioxidant activities of ethanol extract and different polar fractions of Caulophyllum robustum Maxmi.

DAN Fei-jun，YAN Wen-fang，CHU Li-jun，LU Wen-yan，CAI Zheng-jun

（Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development，China Three Gorges University，Yichang 443002，China）

The antioxidant activities of ethanol extract and different polar fractions of Caulophyllum robustum Maxmi. were evaluated by DPPH radical scavenging activity（DPPH·），superoxide radical scavenging activity（O2-·），hydroxyl radical scavenging activity（·OH）and NO2-scavenging assays.The results showed that ethanol extract and different polar fractions displayed high antioxidant activities.ln totally，the antioxidant activities of middle polar fractions were stronger than those of lower and higher polar fractions.

Caulophyllum robustum Maxmi.；ethanol extract；polar fraction；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0068-04

2009-12-18

但飞君（1972-），女，博士，副教授，主要从事天然产物的活性成分研究。

生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金项目（2007005）。