利用冷榨花生饼制备花生多肽饮料

胡志和，郭 嘉

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

利用冷榨花生饼制备花生多肽饮料

胡志和，郭 嘉

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

以冷榨花生饼为原料，采用碱法和酶水解法制备花生蛋白，以蛋白质提取率为指标，确定蛋白提取条件，并利用所提取蛋白或蛋白水解物经乳酸菌发酵制备花生多肽饮料。结果表明NaOH溶液提取花生蛋白的最佳条件为：pH9.0、温度55℃、料液比1:8(g/mL)、浸提2h，蛋白提取率80.68%；胰蛋白酶水解蛋白的最佳条件为：酶与底物比1:50(m/m)、底物质量浓度5g/100mL、pH9.0、水解温度50℃，蛋白提取率96.26%。以花生水解蛋白和脱盐乳清粉为原料，采用直投式乳酸菌为发酵剂，发酵条件为：花生水解蛋白质量浓度2g/100mL、乳清粉加入量1g/100mL、发酵剂与发酵液比1:25(g/kg)、42℃发酵5h、4℃后熟15h、蔗糖质量分数9%时的口感最佳。

冷榨花生饼；花生蛋白；花生多肽；乳酸发酵饮料

我国花生年产量为500～650万吨，榨油后产生的花生饼粕150多万吨。花生饼粕粗蛋白质含量为40%～80%，是非常值得开发的植物蛋白资源。对花生蛋白的提取及其功能性质的研究已有文献报道[1-4]。由于压榨造成花生饼粕中蛋白的变性，造成花生蛋白提取方面的困难，以及压榨造成饼粕氨基酸组成变化，使其营养价值降低，也是影响其开发利用的原因之一。利用酶法直接水解花生饼粕或采用碱提蛋白后水解制备多肽，是目前利用花生饼粕的趋势之一。利用酶水解花生蛋白制备花生多肽的已有文献报道[5-8]，本实验以冷榨花生饼粕为原料，采用NaOH溶液提取蛋白和胰蛋白酶水解花生饼粕提取蛋白水解物，以蛋白提取率为指标比较提取效果。对提取蛋白或水解物采用乳酸菌发酵法制备乳酸发酵饮料，通过乳酸菌发酵，不仅能够产生生理活性成分，还能改善产品风味[9]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷榨油后的花生饼粕 河北唐山粮油食品有限公司；胰蛋白酶(250U/mg) 美国Sigma公司；DEMI90脱盐乳清粉 芬兰维利奥有限公司；YF-L812直投式发酵剂 丹麦汉森公司；所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

EMS-8A型恒温磁力搅拌器 天津欧诺仪器有限公司；KDN-2C型凯氏定氮仪 上海纤检仪器有限公司；HWS24型电热恒温水浴锅、LRH-70型生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；DH-101型电热恒温鼓风干燥箱 天津中环实验电炉有限公司； Scientz-50N型冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型台式离心机 美国Sigama公司；PB-10数字pH计 德国赛多利斯公司；SW-CJ-1F型洁净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

1.3.1.1 主要成分分析

水分含量的测定：GB 5009.3—2010《食品中水分的测定方法：直接干燥法》。蛋白质含量测定：G B 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定：凯式定氮法》。脂肪含量测定：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定：索氏提取法》。淀粉含量测定：GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的测定：酸水解法》。

1.3.1.2 蛋白质提取率的计算比例加入蒸馏水，用1mol/LNaOH溶液调pH值，保温浸提2h后，浸提液4000r/min，离心30min，取上清液倒入已质量恒定的小烧杯中，按照GB 5009.3—2010方法于95～105℃干燥至质量恒定。

1.3.2.2 冷榨花生饼粕蛋白碱提条件优化

选取pH值(A)、温度(B)和料液比(C)三因素三水平进行碱提工艺正交试验，参考文献[7]冷榨花生饼粕碱提工艺，并加以修改，以蛋白质提取率为考察指标，进行L9(33)正交试验。各因素与水平设计见表1。

表1 碱提工艺提取花生蛋白正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing alkaline extraction of peanut protein

1.3.1.3 水解度(degree of hydrolysis，DH)测定

DH测定采用pH-stat法[10-12]。

式中：DH为水解度/%；VNaOH为碱液体积/mL；CNaOH为碱液浓度/(mol/L)；α为氨基的解离度，α= [10(pH-pK)]/[1＋10(pH-pK)]，其中pK值为a-氨基酸的平均pK值，取7.0、pH为反应一开始体系的pH值；mp为底物中蛋白质总质量/g；htot为底物蛋白质所含肽键总数/ (mmol/g)，对于花生蛋白来说，htot＝7.13(根据花生蛋白的氨基酸组成计算得到)。

1.3.2 利用碱提工艺从冷榨花生饼粕中提取花生蛋白1.3.2.1 碱提花生蛋白工艺

将冷榨油后的花生饼粕粉碎，过40目筛，按一定

1.3.3 利用胰蛋白酶水解提取花生多肽

1.3.3.1 酶法提取制备花生蛋白多肽工艺[13-14]

花生饼粕粉碎→加水配成一定的底物质量浓度→调pH9→加热处理(100℃，10min)→冷却→酶解→灭酶(100℃，10min)→冷却→离心(4000r/min，40min)→上清液→超滤(截留分子量10kD)→冷冻干燥→花生水解蛋白肽

1.3.3.2 胰蛋白酶水解花生饼粕单因素试验

在底物质量浓度7g/100mL，温度45℃以及pH8.0的条件下进行不同酶与底物比的水解，酶与底物比(m/m)分别取1:100、1:200、1:400；在酶与底物比为1:100，温度45℃时，pH8.0的条件下进行不同底物质量浓度的水解，底物质量浓度分别取4、7、10g/100mL；在酶与底物比为1:100，底物质量浓度7g/100mL，pH8.0的条件下进行不同温度的水解，温度分别取40、45、50℃；在酶与底物比为1:100，底物质量浓度7g/100mL，温度45℃的条件下进行不同pH值的水解，分别取pH7.0、8.0、9.0。

水解过程及水解产物的处理按1.4.3.1节方法进行，测定其蛋白质含量并计算出水解度。

1.3.3.3 胰蛋白酶水解花生饼粕粉条件优化

根据单因素试验结果，以酶与底物比、底物质量浓度、温度和pH值为影响因素，以蛋白质提取率为考察指标，进行L9(34)正交试验。各因素水平设计见表2。

1.3.4 花生多肽饮料研制

1.3.4.1 花生多肽饮料工艺条件

表2 胰蛋白酶水解冷榨花生饼正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing enzymatic extraction of peanut protein

花生蛋白多肽粉→加水(配成一定的底物质量浓度)→加入脱盐乳清粉→加热灭菌(100℃，5min)→冷却→接种→乳酸发酵→后发酵→调配→冷藏→成品

以1.3.3.3节优化条件制备花生蛋白水解液，调整至pH7.0，4000r/min离心40min，取上清液，经超滤后，进行冷冻干燥，将花生蛋白多肽溶解至一定底物质量浓度，加入一定量的乳清粉混合均匀，沸水浴灭菌5min，迅速冷却，将直投式发酵剂按一定比例接种，搅拌均匀，在42℃下进行发酵，以pH值不再变化作为发酵终点，然后在4℃条件下后发酵15h。

1.3.4.2 制备花生多肽饮料的正交试验

制备花生多肽饮料时，选取底物质量浓度(A)、乳清粉加入量(B)、发酵剂与发酵液比(C)三因素，各取三水平，按正交设计试验方案，以感官评价评分为参考指标，进行L9(33)正交试验。各因素与水平设计见表3。苦味、异味，评定分数标准采用1～7分制，分别对应很差、差、较差、一般、较好、好、很好，评分方法见表4。

1.3.4.4 花生多肽饮料甜酸比调配

按照1.3.4.2节得出的最优条件制得的花生蛋白多肽发酵液，按照不同配比加入白砂糖，搅拌使其充分溶解，白砂糖的质量分数分别为8%、9%、10%，根据口感进行评比。

2 结果与分析

2.1 冷榨花生饼的主要成分

冷榨花生饼经测定分析，其蛋白质、脂肪、淀粉等主要成分含量见表5。

表5 冷榨花生饼的主要成分Table 5 Main components of cold pressed peanut cake

表3 制备花生多肽饮料L9(33)正交试验因素水平表Table 3 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing fermentation of hydrolyzed peanut protein and desalted whey powder

1.3.4.3 感官评价

表4 花生多肽饮料感官品质评分标准Table 4 Standards for sensory evaluation of peanut polypeptide beverage

2.2 碱法提取花生饼粕蛋白条件优化

根据方法1.3.2.2节设计，按表1进行正交试验，得到碱提花生蛋白的试验结果见表6。

表6 利用碱提工艺提取花生蛋白正交试验设计及结果Table 6 Orthogonal array design and corresponding results foroptimizing alkaline extraction of peanut protein

感官评价的方法采用评分评价法，对花生发酵饮料感官进行综合评分，评审项目包括香味、咸味、酸度、

由表6可知，通过对碱提工艺提取花生蛋白所得产物进行蛋白质含量测定，得出三种因素对蛋白质提取率结果影响大小依次为A＞B＞C，即pH值＞温度＞料液比，最优组合为A2B3C2，即pH9.0、提取温度55℃、料液比1:8。根据此条件进行验证实验，结果蛋白质提取率为80.68%。

2.3 胰蛋白酶水解花生饼粕蛋白制备多肽的条件确定

2.3.1 酶与底物比对花生蛋白提取率和水解度的影响

图1 不同酶与底物比的水解进程曲线Fig. 1 Hydrolysis curves of cold pressed peanut cake at different levels of enzyme/substrate ratio

图2 酶与底物比对花生蛋白提取率和水解度的影响Fig. 2 Effect of enzyme/substrate ratio on protein extraction rate and DH (degree of hydrolysis)

由图1、2可知，酶与底物比越大，水解的速度越快，水解度越大，蛋白提取率越大，3种条件下水解时间为200min趋于水解完全。因此，酶与底物比1:100，水解200min水解效果较好。

2.3.2 底物质量浓度对蛋白提取率和水解度的影响

图3 不同底物质量浓度的水解进程曲线Fig. 3 Hydrolysis curves of cold pressed peanut cake at different substrate concentrations

图4 底物质量浓度对花生蛋白提取率和水解度的影响Fig. 4 Effect of substrate concentration on protein extraction rate and DH

由图3、4可知，底物质量浓度对冷榨花生饼粕粉水解度影响不大，3种条件下水解200min水解趋于完全。在试验范围内，蛋白提取率随底物质量浓度增而降低。

图5 不同水解温度的水解进程曲线Fig. 5 Hydrolysis curves of cold pressed peanut cake at different hydrolysis temperatures

2.3.3 温度对蛋白提取率和水解度的影响

由图5、6可知，在40、45、50℃条件下，水解200min水解趋于完全；随着温度的升高水解速度增快，水解度和蛋白提取率都增大。酶解温度的高低与蛋白酶分子的稳定性密切相关，这是因为蛋白酶分子的肽键具有特定的空间结构，若反应温度过低，则会大幅降低体系内分子运动的巨烈程度，以致降低蛋白酶与底物的碰撞机率；若反应温度超过一定限度，极易引起次级键解离，从而致使蛋白酶丧失或部分丧失催化活性[15]。因此胰蛋白酶水解冷榨花生饼的较适温度为50℃。

2.3.4 pH值对蛋白提取率和水解度的影响

图7 不同pH值的水解进程曲线Fig. 7 Hydrolysis curves of cold pressed peanut cake at different levels of pH

图8 pH值对花生蛋白提取率和水解度的影响Fig. 8 Effect of pH on protein extraction rate and DH

由图7可知，3种pH值条件下水解200min趋于完成；由图8可知，在试验范围内，随着pH值的增大，蛋白的水解度和提取率随着增大。

pH值对酶促反应的影响，主要体现在对酶活力的影响，pH值影响酶的活力的原因主要有3个方面：一是过酸或过碱可以破坏酶的空间结构，改变酶的构象，使酶的活性丧失；二是当pH值稍微变化时，酶虽未变性，但pH值可影响底物的解离状态、也可影响酶分子活性部位上部分基团的解离，从而影响与底物的结合以及催化；三是pH值影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响酶活性部位的构象，进而影响酶的活性[16-17]。

2.3.5 胰蛋白酶水解花生饼粕蛋白提取多肽的条件优化

根据方法1.4.3.3节正交因素水平表进行正交试验，结果见表7。

由表7可知，通过对用胰蛋白酶水解冷榨花生饼所得到的花生水解蛋白和多肽粉进行蛋白质含量测定，得出三种因素对蛋白质提取率结果影响大小依次为A＞D＞C＞B，即酶与底物比＞底物质量浓度＞pH值＞温度，最优组合为A1B2C2D1，即酶与底物比1:50、底物质量浓度5g/100mL、pH9、提取温度50℃。根据此条件进行验证实验，结果蛋白质提取率为96.26%。

表7 胰蛋白酶水解冷榨花生饼正交试验设计及结果Table 7 Orthogonal array design and corresponding results foroptimizing enzymatic extraction of peanut protein

2.4 制备花生多肽饮料

根据上述研究结果，选择酶法水解花生饼粕，提取分离花生蛋白肽，用于乳酸发酵饮料的制作。

2.4.1 发酵过程中pH值的变化

花生多肽饮料发酵过程中体系pH值的变化如图9所示。

图9 发酵过程中花生多肽饮料体系pH值的变化Fig.9 Changes of pH of peanut polypeptides beverage system in fermentaion process

由图9可知，当底物质量浓度、乳清粉加入量、发酵剂与发酵液比等因素不同(表8)，在42℃发酵，各样品的发酵速度不同，产酸量也有差异，总体上，各因素水平下发酵时间在4～8h。结合对水解物的苦味和异味消减的评价(表8)可知，发酵速度快，产酸较多的样品(样品1、2、3、6)对苦味和异味的消减效果越好。2.4.2 花生发酵饮料的正交试验结果

按1.3.4.2节试验设计进行正交试验，结果见表8。

表8 制备花生多肽饮料的正交试验设计及结果Table 8 Orthogonal array design and corresponding results for optimizing fermentation of hydrolyzed peanut protein and desalted whey powder

由表8可知，通过对经发酵制得的花生多肽饮料进行感官评价，得出3种因素对产品品质影响的主次顺序为A＞C＞B，即底物质量浓度＞发酵剂与发酵液比＞乳清粉的加入量，最优组合为A1B1C2，即底物质量浓度2g/100mL、乳清粉的加入量1%、发酵剂与发酵液比1:25(g/kg)、42℃发酵时间5h、4℃后熟15h，产品其感官评价相对较好。

2.4.3 花生多肽饮料最优甜酸比确定

经过后熟后的发酵液调整甜酸口味，确定蔗糖质量分数9%时的口感最佳，此产品具有浓郁的乳酸发酵香味，甜酸比适宜，无咸味、苦味和其他异味。

3 结 论

碱提花生蛋白优化的提取条件：pH9、提取温度55℃、料液比1:8(m/m)、浸提2h，蛋白提取率80.68%。

用胰蛋白酶水解提取花生蛋白和多肽，取条件为：酶与底物比1:50(m/m)、底物质量浓度5g/100mL、pH9、提取温度50℃、水解200min，蛋白提取率96.26%，水解度15.37%。

以花生多肽粉和脱盐乳清粉为主要原料，乳酸发酵制备多肽饮料条件为：花生蛋白多肽浓度2g/100mL、乳清粉加入量1g/100mL、发酵剂与发酵液比1:25(g/kg)、42℃发酵时间5h、4℃后熟15h、蔗糖质量分数9%时的口感最佳。

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Preparation of Peanut Polypeptide Beverage Using Cold Pressed Peanut Cake

HU Zhi-he，GUO Jia
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

In this study, NaOH and trypsin were used to hydrolyze cold pressed peanut cake as a byproduct of the cold pressed extraction of peanut oil to obtain peanut protein. Orthogonal array design was employed to optimize the hydrolysis conditions of cold pressed peanut cake for maximum extraction efficiency of protein. The optimal NaOH treatment conditions were pH 9.0, 1:8 material/liquid ratio (g/mL), 8 ℃ extraction temperature, and 2 h extraction time, resulting in an extraction efficiency of 80.68%. The optimal trypsin treatment conditions were 1:50 enzyme/substrate ratio (m/m), 5 g/100 mL substrate concentration, pH 9.0 and 50 ℃ hydrolysis temperature, and the resulting extraction efficiency of protein 96.26%. The optimal conditions for fermentation of hydrolyzed peanut protein obtained using trypsin and desalted whey powder by direct vat set (DVS) lactic-acid bacteria starter for peanut polypeptide beverage with the best taste were hydrolyzed peanut protein amount 2 g/100 mL, desalted whey powder 1 g/100 mL, innoculum amount 1:25 (g/kg), fermentation at 42 ℃ for 5 h, post-aging for at 4 ℃ for 15 h and amount of sucrose addition in fermentation products 9%.

cold pressed peanut cake；peanut protein；peanut polypeptides；lactic acid bacteria-fermented beverage

TS275.4

B

1002-6630(2011)20-0335-06

2011-06-23

胡志和(1962—)，男，教授，硕士，研究方向为专用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn