荧光染料E MA在实时荧光P C R定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用

祝儒刚

(辽宁大学轻型产业学院，辽宁省食品生物加工工程技术研究中心，辽宁 沈阳 110036)

荧光染料E MA在实时荧光P C R定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用

祝儒刚

(辽宁大学轻型产业学院，辽宁省食品生物加工工程技术研究中心，辽宁 沈阳 110036)

将荧光染料——叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide，EMA)与实时荧光-聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)技术相结合，对其在RT-PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用进行研究。纯培养条件下，在2.2×102～2.2×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性，并且不添加EMA时的检测灵敏度(22CFU)略大于添加EMA(2.2×102CFU)时的检测灵敏度；人工污染牡蛎样品，利用RT-PCR和EMA RT-PCR以及平板计数法分别进行副溶血弧菌定量检测，结果表明EMA RT-PCR更接近于平板计数的结果，单纯RT-PCR定量的结果偏大；在采集的45份海产品样品中，不经富集培养，利用EMA RT-PCR方法仅有一份牡蛎样品呈阳性，牡蛎样品污染程度为114CFU/g。该方法能够快速、灵敏、准确地进行海产品中致病性副溶血弧菌活细胞的定量检测，具有很好的应用价值。

叠氮溴乙锭(EMA)；实时荧光聚合酶链式反应(RT-PCR)；海产品；活细胞；副溶血弧菌检测

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是水产品中引起食物中毒的重要病原菌之一，在海产品中的携带率高达4 5.7%，其中牡蛎、毛蚶、泥螺、扇贝、龙虾、蟹、章鱼、蛤、鳕是副溶血性弧菌的主要侵染对象。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已成为我国首要的食源性致病菌[1-3]。

近年来，一些基因水平的检测方法，如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法和实时荧光PCR(real-time PCR，RT-PCR)方法，由于在检测病原菌方面快速、高灵敏度和高特异性等优点，已经显示出长远的发展前景。然而，在食品检测方面，死菌DNA长期存在使基因水平的检测方法高估了样品中活菌的水平，有时甚至出现检测的假阳性结果。荧光染料叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide，EMA)能选择性抑制死细胞DNA的PCR扩增，而对活细胞DNA的PCR扩增几乎没有影响。因此，EMA与RT-PCR技术相结合，能更加准确地检测出样品中活菌细胞的存在[4-9]。

目前，关于EMA与实时RT-PCR相结合定量检测食品中致病菌活细胞的报道非常少，仅有创伤弧菌和副溶血弧菌[10-12]。已有的报道也只是对EMA应用于RTPCR的条件进行摸索，以及对EMA区分鉴别死活细胞的能力进行证实。本实验在证实EMA可区分鉴别死活细胞的基础上，着重研究其在RT-PCR定量检测海产品中副溶血弧菌活细胞中的应用，具有普遍应用意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

扇贝、牡蛎、毛蚶样品(各15份，每种海产品中8份来自海鲜批发市场、7份来自零售早市)；标准菌株、副溶血弧菌ATCC17802 本实验室保存。

EMA 美国Sigma公司；LightCyclerOR480 SYBR GreenⅠ(cat. no.04707516001)罗氏荧光染料试剂盒 德国Roche Diagnostics公司；EZ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒 生工生物工程(上海)有限公司；胰胨肉汤(蛋白胨2%、NaCl 4%、0.01%的结晶紫溶液0.5%、pH9.0)、T1N3(1%蛋白胨、3% NaCl、2%琼脂)琼脂。

LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 德国Roche Diagnostics公司；Stomacher 400型高效自动均质器 英国Seward公司；752N紫外-可见分光光度计 西安明克斯检测设备有限公司；卤钨灯(500W)。

1.2 细菌培养及活细胞热致死时间确定

副溶血弧菌标准菌株ATCC 17802经活化后转接胰胨肉汤液体培养基，37℃、150r/min条件下过夜培养。收集菌体，经0.85%灭菌生理盐水洗涤两次后，重悬于生理盐水中。取定量菌悬液梯度稀释，测定每个梯度的OD600nm并涂T1N3琼脂平板，37℃恒温培养48h后测定活菌数。以活菌数(x轴)和OD600nm值(y轴)做标准曲线，并且在本实验中，均以此标准曲线调整菌液浓度[12]。3次独立实验，每次独立实验3次重复[13-15]。

取上述经洗涤的菌悬液，调整其浓度为4×108CFU/ mL，分别取0.5mL于1.5mL离心管中，95℃水浴加热，每隔30s取样涂平板，37℃过夜培养并计数，此实验重复3次取平均数。

1.3 EMA抑制热致死副溶血弧菌细胞DNA RT-PCR扩增能力测定

经0.85%灭菌生理盐水洗涤的菌悬液，调整浓度后分别取0.5mL转移至完全相同的5个离心管，每管内活细胞数分别达到2×107、2×106、2×105、2×104、2×103CFU。95℃水浴加热10min活细胞致死处理后，冷却至室温。另一组实验，同样准备5个完全一样的离心管，每个离心管装0.5mL菌悬液，活细胞数分别达到2×107、2×106、2×105、2×104、2×103CFU，不经过水浴加热活细胞致死处理。0.5mL灭菌生理盐水而不含副溶血弧菌细胞的离心管作为阴性对照[16-17]。

向两组实验菌悬液中分别加入0.1mg/mL的EMA，使EMA终质量浓度均达到1.0μg/mL。将菌悬液在黑暗处室温放置5min，然后将离心管开盖放置冰上，在距离灯管16cm处曝光20min。曝光后的混合菌悬液在10000r/min离心5min，收集菌体。倒掉上清液后将菌体重悬在0.5mL生理盐水中，10000r/min再次离心5min，收集菌体，倒掉上清液，再次重悬于0.5mL生理盐水中，裂解法提取DNA后用于RT-PCR[18-19]。

1.4 DNA模板制备[20]

用TZ裂解液(2.0% Triton X-100、2.5mg/mL的叠氮化钠、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液、pH8.0)提取模板DNA。经EMA处理曝光后的菌悬液与等体积的2×TZ裂解液混匀，沸水浴10min后冷却至室温，10000r/min离心10min去掉菌体碎片沉淀，取上清液直接用作RT-PCR模板。

1.5 标准曲线的制作

取过夜培养的副溶血弧菌(ATCC 17802)菌悬液，菌体用灭菌生理盐水洗涤两次，调整菌悬液浓度约为4× 108CFU/mL。10倍梯度稀释，得到菌浓度范围4×107～4CFU/mL。

完全一样的两组实验，向每组8个完全相同的离心管内分别加入0.5mL菌悬液，每管细胞数分别为2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2× 101、2CFU。其中一组分别加入0.1mg/mL EMA，使EMA终质量浓度均达到1.0μg/mL，然后如上进行曝光处理；另一组不添加EMA。0.5mL灭菌生理盐水而不含副溶血弧菌细胞的离心管作为阴性对照。3次独立实验，每次独立实验3次重复。两组实验离心收集菌体后，用柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提DNA，溶于20μL灭菌水中备用[21-23]。

每个稀释度精确的活菌数通过取其中一个稀释度的菌悬液涂T1N3琼脂平板后，37℃培养48h计数获得。

1.6 人工污染牡蛎组织中致病性副溶血弧菌细胞的RTPCR和EMA RT-PCR定量检测

调整菌悬液浓度约为4×108CFU/mL，10倍梯度稀释，得到菌浓度范围4×108～4×103CFU/mL。

牡蛎样品来自当地海产品零售市场，在无菌均质袋内，无菌操作剪碎5g样品于44mL灭菌胰胨肉汤液体培养基，利用高效自动均质器均质，无菌操作每个浓度水平取1mL分别接种，混匀。

吸取每个样品10mL，800r/min离心10min，除去牡蛎细胞碎片，上清液转移到新的离心管中，10000r/min离心10min收集菌体，将菌体重悬于1mL灭菌生理盐水中。一管用于平板计数，另一管分成两个0.5mL，其中一个0.5mL经EMA处理后用柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提DNA用于RT-PCR定量，另一个0.5mL菌悬液不经EMA处理直接抽提DNA用于RT-PCR定量[16]。

定量结果的表现形式为lg(CFU/g)(以牡蛎组织质量计)。将平板计数的结果与RT-PCR和EMA RT-PCR定量结果相比较。为确保牡蛎样品不含trh阳性副溶血弧菌，取1g样品加入50mL胰胨肉汤培养基中，37℃、150r/min过夜培养后，取菌液做RT-PCR鉴定。

1.7 海产品中致病性副溶血弧菌活细胞的定量检测

最常见且最易被副溶血弧菌污染的扇贝、牡蛎、毛蚶样品用专用的无菌采集袋采集，跟预先准备好的冰袋一起迅速送回分析实验室，并在24h内做分析处理。样品经去壳和除去杂质处理后，无菌操作每份样品取5g内容物转移至45mL胰胨肉汤培养基中，在均质袋内用高效自动均质器均质1min。吸取每个样品10mL，800r/ min离心10min，除去细胞碎片，上清转移到新的离心管中，10000r/min离心10min收集菌体。将菌体重悬于0.5mL无菌水中，添加EMA，使其终质量浓度达到1.0μg/mL。将菌悬液在黑暗处室温放置5min，然后将离心管开盖放置冰上，在距离灯管16cm处曝光20min。曝光后的混合菌悬液10000r/min离心5min，收集菌体。倒掉上清液后将菌体重悬在0.5mL的无菌水中，10000r/ min再次离心5min，收集菌体，弃去上清液，再次重悬在50μL无菌水中[12]。利用柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提DNA，溶于20μL灭菌水中备用。

1.8 引物及RT-PCR扩增

实验采用实时荧光定量PCR仪。病原性副溶血弧菌致病基因trh检测引物上游(P1)为：5′-TTGCTTTCAG TTTGCTATTGGCT-3′；下游引物(P2)为：5′-GCTAC TTTCTAGCATTTT CTCTGC-3′，扩增片段长度为300bp。20μL的扩增体系包括：10μL荧光染料混合液，5μL模板D N A，上下游引物各1μL(10μmol/L)、3μL PCR级无菌水。RT-PCR反应体系：94℃预变性10min，35个循环，每个循环94℃ 20s，55℃ 20s，72℃30s[12]。每个RT-PCR反应重复3次，得到平均Ct值和标准背离值。

1.9 数据分析

所得数据以“平均值±标准差”表示，应用SPSS 11.0统计软件对实验数据进行t检验，P＜0.05表示具有差异显著性。

2 结果与分析

2.1 副溶血弧菌的热致死时间

95℃水浴处理副溶血弧菌菌悬液(OD600nm为0.7，4×108CFU/mL)[12]，每隔30s取样涂平板，每个样品设3个重复，37℃过夜培养后观察计数(图1)。结果表明，随着热处理时间的增加，其平板菌落数逐渐减少，当热处理时间延长到9min时，副溶血弧菌已失活，平板上没有菌落生长，平板计数为零。因此，为了确保所有副溶血弧菌完全被杀死，得到结果：将浓度为4× 108CFU/mL的副溶血弧菌菌悬液在95℃水浴处理10min，所有副溶血弧菌细胞都已经杀死，平板计数为零。

图1 不同加热时间处理后的副溶血弧菌活细胞数Fig.1 Viable cell counts of Vibrio parahaemolyticus during thermal treatment

2.2 EMA抑制热致死副溶血弧菌细胞DNA RT-PCR扩增

经EMA处理，当活细胞数由2×107减少到2×103时，Ct值从18.52±0.52线性增大到27.49±0.41；同样经EMA处理的热致死细胞，当细胞数由2×107CFU/g减少到2×103CFU/g时，对应RT-PCR的Ct值从28.8±0.41 变化至30.21±0.39，此时阴性对照(无细菌细胞)的Ct值为30.5±0.70(图2)。这表明，对热致死细胞来说，EMA完全有效地抑制了其DNA的RT-PCR扩增，在R T-PCR扩增体系中，几乎不存在可扩增的DNA，因此其Ct值与阴性对照的Ct值无显著差异(P＞0.05)；而EMA对活细胞DNA的RT-PCR扩增几乎没有影响，随着细胞数的减少，Ct值逐渐增大，各Ct值与阴性对照均存在显著差异(P＜0.05)。

图2 EMA抑制热致死细胞DNA RT-PCR扩增能力Fig.2 Inhibitory effect of EMA on RT-PCR amplification of DNA from thermally inactivated Vibrio parahaemolyticus cells

2.3 定量标准曲线

表1 添加和不添加EMA样品的Ct值与菌落数关系Table 1 Relationship between CFU and Ct value of samples with and without EMA treatment

图3 添加和不添加EMA情况下细胞常用对数值与Ct值的标准曲线Fig.3 Standard curves between Log CFU and Ct with and without the addition of EMA

理论上，基于已知的细胞数量和对应Ct值所获得的标准曲线可以通过RT-PCR对不同来源样品中的细胞数进行定量。本实验结果表明，对于RT-PCR(22×107～2.2× 107CFU范围内)和EMA RT-PCR(2.2×102～2.2×107CFU范围内)，Ct值与细胞对数之间具有非常好的线性关系，其相关系数分别为0.9883和0.9987。相同条件下，RTPCR的检测灵敏度高于EMA RT-PCR的灵敏度，分别为22CFU和2.2×102CFU。并且，相同细胞浓度下，EMA RT-PCR的Ct值大于RT-PCR约1～2个循环(表1、图3)。阴性对照没有检测到副溶血弧菌细胞存在。本研究的随后实验当中，对于经EMA或不经EMA处理的样品，均用此标准曲线来对样品中的细菌数进行定量。

2.4 人工污染牡蛎组织中致病性副溶血弧菌RT-PCR和EMA RT-PCR定量检测与平板计数比较

分别用RT-PCR、EMA RT-PCR和平板计数法对6个稀释梯度的人工污染牡蛎组织中的总致病性副溶血弧菌进行定量。RT-PCR和EMA RT-PCR的定量Ct值通过图3的标准曲线计算出lg(CFU/g)，结果如表2所示。总体来说，RT-PCR和EMA RT-PCR的定量结果与平板计数的结果均非常接近，其中EMA RT-PCR的定量结果更接近于平板计数的结果，略为偏低；而RT-PCR的定量结果偏离平板计数的结果稍大一些，大于EMA RT-PCR和平板计数的结果(P＜0.05)。由于检测灵敏度的关系，EMA RT-PCR没有检测出4×103CFU/mL污染梯度样品中的副溶血弧菌。这表明，EMA RT-PCR技术可以代替平板计数的方法定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞，可以大大缩短定量时间。

表2 RT-PCR、EMA RT-PCR和平板计数法测定人工污染牡蛎中细菌总数的比较Table 2 Comparison of total bacterial counts in artificially contaminated oyster determined by RT-PCR, EMA RT-PCR and plate count methods

2.5 实际海产品样品中致病性副溶血弧菌活细胞检测

利用EMA RT-PCR技术对实际样品进行定量检测。结果表明，15份牡蛎样品中，一份样品呈致病性副溶血弧菌阳性，样品采自零售早市，含菌量为114CFU/g，其余未检出致病性副溶血弧菌的样品经6h富集培养后，又有一份零售早市样品呈阳性，富集后的菌浓度为2.8× 103CFU/mL。富集前，15份扇贝和15份毛蚶均为致病性副溶血弧菌阴性；经6h富集培养后，两份毛蚶和一份扇贝检测出致病性副溶血弧菌阳性，一份毛蚶来自海鲜批发市场、一份来自零售早市，富集后的菌浓度分别为3.7×103、2.5×103CFU/mL，阳性扇贝样品也采自零售早市，富集后的菌浓度为2.9×103CFU/mL。

3 讨 论

EMA能渗透到细胞壁或细胞膜不完整的死细胞体内并插入DNA共价结合，随后基于DNA的PCR检测方法就不能扩增死细胞DNA；而活细胞的完整细胞壁、活细胞膜能够阻止EMA渗透到菌体内与DNA共价结合，因而其PCR扩增不受影响。EMA的这种性质为PCR方法检测区分海产品中致病性副溶血弧菌死活细胞提供了可靠的方法依据。传统的平板计数法能定量检测活细胞，但是所需时间较长，而单独的RT-PCR也只能定量检测总的细胞数，而将EMA与RT-PCR结合则能够准确检测出存活于海产品中的致病性副溶血弧菌，并且定量检测可在4h内完成，大大缩短了定量的时间[24]。

添加和不添加EMA情况下Ct值与细胞数常用对数值之间的标准曲线表明，Ct值与细胞数常用对数值之间存在严格的负相关性，添加EMA和不添加EMA时的相关系数分别达到0.9987和0.9883。并且添加EMA时的检测灵敏度低于不添加EMA的灵敏度，两者分别为2.2× 102CFU和22CFU，这表明EMA的添加会对检测的灵敏度有一些影响，这可能是由于高浓度的EMA也会对少量活细胞DNA的扩增有影响所致。这一点在对比RTPCR和EMA RT-PCR方法对人工污染牡蛎样品中致病性副溶血弧菌的定量检测时也有所体现，相同的人工污染副溶血弧菌浓度条件下，EMA RT-PCR定量的结果最小，平板计数的结果居中，普通EMA RT-PCR的结果最大(P＜0.05)[25-27]。

从采集的45份海产品样品的检测结果可以看出，零售早市采集的样品污染致病性副溶血弧菌的几率高于从各大海鲜批发市场采集的样品，这跟海产品所处的环境以及新鲜程度有很大关系。

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Application of Ethidium Bromide Monoazide for Quantification of Pathogenic Viable Cells ofVibrio parahaemolyticusin Seafood Using Real-time Polymerase Chain Reaction

ZHU Ru-gang
(Engineering Technology Research Center for Food Biology Processing of Liaoning Province, College of Light Industry, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

The pathogenic viable cells ofVibrio parahaemolyticusin seafood were detected using real-time polymerase chain reaction combined with ethidium bromide monoazide (EMA) dye. For pure culture, there was a negative correlation between the log number of cells and the associated Ct value in the range of 2.2 × 102to 2.2 × 107CFU, and the detection sensitivity of single RT-PCR (22 CFU) was slightly higher than that of EMA RT-PCR(2.2×102CFU). For artificially contaminated oyster samples, similar results were obtained from EMA RT-PCR and plate count method, and slightly lower results from single RT-PCR. Without enrichment, only one positive sample was detected in forty-five seafood samples by EMA RT-PCR with a viableVibrio parahaemolyticuscell of 114 CFU/g. In conclusion, EMA RT-PCR could provide a rapid, sensitive and accurate way for the quantitative detection ofVibrio parahaemolyticusin seafood.

ethidium bromide monoazide (EMA)；real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)；seafood；viable cells；Vibrio parahaemolyticusdetection

TS201.6

A

1002-6630(2011)20-0206-05

2010-12-02

辽宁大学青年科学基金项目(2009LDQN21)

祝儒刚(1980—)，男，讲师，博士研究生，研究方向为食品微生物与分子生物学。E-mail：zrg_luck@163.com