高效液相色谱法测定罗非鱼肌肉中硝基咪唑类多组分残留量

王 扬，郑重莺，何 丰，叶磊海

(浙江省水产质量检测中心，浙江 杭州 310012)

高效液相色谱法测定罗非鱼肌肉中硝基咪唑类多组分残留量

王 扬，郑重莺，何 丰，叶磊海

(浙江省水产质量检测中心，浙江 杭州 310012)

建立一种同时测定罗非鱼肌肉中甲硝唑、地美硝唑、奥硝唑、替硝唑、洛硝哒唑5种硝基咪唑类药物残留量的反相高效液相色谱法。水产品肌肉组织经匀浆，加氯化钠、磷酸氢二钾和乙酸乙酯振荡提取，取有机相浓缩，残余物加盐酸和乙酸乙酯溶解，正己烷去脂后过MCX柱，2%浓氨水甲醇溶液洗脱，色谱柱分离，以醋酸氨缓冲液-乙腈(86:14，V/V)为流动相，320nm紫外检测。结果显示：测定肌肉组织中5种硝基咪唑类药物的最低检测限均为1.0μg/kg。在2.0μg/kg的加样水平下，甲硝唑、地美硝唑、奥硝唑、替硝唑及洛硝哒唑在罗非鱼中的回收率分别为73.3%%、74.7%、62.9%、74.4%、80.1%；测定的标准偏差不大于10%。本方法简便、灵敏度高，准确度和精密度均符合我国农业部兽药残留分析方法的要求。

固相萃取；高效液相色谱法；罗非鱼；硝基咪唑

硝基咪唑类药物(nitroimidazoles)属于硝基杂环化合物，主要有甲硝唑、二甲硝咪唑、替硝唑、奥硝唑、洛硝达唑、地美硝唑等。硝基咪唑类药物的抗原虫活性和抗厌氧菌活性受到人们的广泛重视。体内外毒理实验证实，硝基咪唑类药物对某些动物具有致癌、致突变、损伤DNA等作用[1]，对人体具有潜在致癌性。欧盟已于1993年规定禁止食品动物使用洛硝哒唑，现己全面禁止使用该药，且规定可食性动物组织中硝基咪唑类药物不得检出[2-3]。我国农业部规定“禁止甲硝唑、地美硝唑作为饲料添加剂用于食品动物，禁止洛硝达唑用于所有食品动物的任何用途”[4]。

目前，国内外已有报道，研究在禽肉、蜂蜜等动物源性食品中硝基咪唑的测定方法主要有免疫法[5]、气相色谱法[2,6]、高效液相色谱法[7-9]、液相色谱-质谱联用法[10-12]和气相色谱-质谱联用法[13]，但免疫法的检测项目有限，气相色谱-质谱(gas chromatography-mess spectrometry，GC-MS)法需要进行衍生，GC法的灵敏度不过高。我国现有的水产行业标准中缺少硝基咪唑类药物残留的测定方法标准，尚未见在水产品中同时检测5种硝基咪唑类药物的报道。本实验以固相萃取法为净化手段，采用液相色谱-紫外检测技术，建立测定罗非鱼肌肉中硝基咪唑类多组分残留的方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

甲硝唑、地美硝唑、奥硝唑、替硝唑、洛硝哒唑标准品(纯度均为99.0%) 美国Sigma公司；乙腈、甲醇(均为色谱纯) 美国天地公司；其他试剂无特别说明均为分析纯；水为超纯水。

1100高效液相色谱仪(配紫外检测器) 美国Agilent公司；组织匀浆机 江苏国华公司；旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司；恒温振荡器 金坛市富华仪器有限公司；DK-S24型恒温水浴锅 上海森信仪器公司；氮吹仪 美国Organomation公司；Oasis MCX固相萃取柱(3CC) 美国Waters公司；纯水过滤装置 法国Millipore公司。1.2 方法

1.2.1 醋酸缓冲液的配制

称取0.82g无水醋酸钠溶解于800mL水中，以冰醋酸调节pH4.3，加水定容至1000mL。

1.2.2 浓氨水甲醇溶液的配制

准确移取2mL浓氨水，用甲醇定容到100mL。1.2.3 标准品溶液的制备

称取甲硝唑、地美硝唑、奥硝唑、替硝唑、洛硝哒唑标准品各10.0mg，混合后用甲醇溶解并定容到100mL，质量浓度为100μg/mL的混合标准贮备液(冷藏保存，可保存6个月)；标准工作液：临用时准确移取贮备液，用流动相稀释，配制成系列质量浓度的标准工作液。1.2.4 样品前处理

准确称取10.00g肌肉，放到组织捣碎机中，加入2.0g氯化钠和2.0g磷酸氢二钾，均质，加入20.0mL乙酸乙酯，40℃振荡提取60.0min，过滤，用20.0mL乙酸乙酯重复提取，合并滤液，在旋转蒸发仪浓缩至干。

用1mL 1.0moL/L盐酸和1.5mL乙酸乙酯洗涤旋发瓶，转移到20.0mL的分液漏斗，重复用1mL 1.0moL/L盐酸和1.0mL乙酸乙酯洗涤，一起转移到分液漏斗，加入5.0mL正己烷，振荡，静置30min，收集下层。样品过MCX柱(预先用2.0mL甲醇、2.0mL水冲洗)，让样品在自然重力下流出，吹干，加3.0mL水洗柱，加3.0mL体积分数2%的浓氨水-甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，水浴40℃以氮气吹至0.5mL，用流动相定容至1.0mL，经过0.45μm滤膜过滤后，供液相色谱测定。

1.2.5 色谱条件

色谱柱为HC C18柱(250×4.6mm，5μm)；流动相为醋酸缓冲液-乙腈(86:14，V/V)，使用前以0.45μm滤膜过滤，并超声脱气；流速1.0mL/min；色谱柱温30℃；进样量30μL；检测波长320nm。当样品图谱和标准品色谱峰保留时间一致时，采用DAD对该色谱峰进行紫外光谱特征扫描，作为定性的依据，以避免假阳性结果的出现。

2 结果与分析

2.1 提取液的选择

由于硝基咪唑类药物具有两性性质，即在弱碱性条件下呈游离分子状态，在弱酸性条件下质子化，因此加入磷酸氢二钾使溶液呈弱碱性，以便于加硝基咪唑类物质完全从样品中提取出来[7,11]。国内外文献报道中多使用二氯甲烷、乙腈和乙酸乙酯作为提取溶剂[8-10]。本实验对比了该3种提取液的提取效果，发现针对提取样品中甲硝唑、地美硝唑、奥硝唑、替硝唑、洛硝哒唑5种成分的回收率，乙酸乙酯依次高于乙腈和二氯甲烷，二氯甲烷、乙腈提取液中杂质含量明显高于乙酸乙酯，乙腈去蛋白效果好，但乙腈与水互溶，进一步萃取时乳化现象较严重，且乙腈沸点较高，提取后不容易蒸干浓缩。采用乙酸乙酯提取动物肌肉组织中的硝基咪唑类药物，在提取液中加磷酸氢二钾，使溶液呈弱碱性，加入氯化钠，其盐析作用可以提高回收率。2.2 净化条件的选择

萃取样品的乙酸乙酯液中含有较低极性的杂质，如蛋白质、脂肪等脂溶性物质，液-液萃取时容易乳化，因此考虑采用固相萃取法净化样品。因此选用HLB、C18、MCX三种不同填料的萃取小柱，比较回收率和峰型图(图1)可以看出。使用MCX柱时不仅峰形好而且5种硝基咪唑类药物的回收率均较高。

图1 使用MCX柱净化罗非鱼样品中添加硝基咪唑类药物色谱图Fig.1 Chromatogram of nitroimidazoles in tilapia muscle samples using MCX SPE

离子交换固定相上组分的保留和洗脱主要决定于流动相中的离子强度、反离子强度和pH值，与溶剂强度关系较小[1]。国内外报道中，分析硝基咪唑类药物使用了很多类型填料的固相萃取柱[7,11]。硝基咪唑类药物为弱碱性药物，可在阳离子交换柱上有效保留，所以本实验选择强阳离子交换树脂固相萃取柱(MCX柱)净化。

在罗非鱼空白样品中添加标准品2.0μg/kg时，采用乙腈、甲醇、体积分数2%的浓氨水甲醇3种不同的洗脱液计算回收率。结果显示，2%浓氨水-甲醇溶液做洗脱液时，甲硝唑、地美硝唑、奥硝唑、替硝唑、洛硝哒唑的回收率均比乙腈和甲醇高，分别为73.3%、74.7%、62.9%、74.4%、80.1%。所以确定洗脱液为2%浓氨水-甲醇溶液。

通过不同体积洗脱液比较硝基咪唑类药物的回收率。洗脱液体积为3～5mL时，硝基咪唑类药物的回收率相差不多，考虑到后续的氮吹过程中洗脱液体积较少较节约时间，故确定洗脱液的体积为3mL。

2.3 色谱条件的选择

高效液相色谱法检测微量药物的分离条件不仅要求尽量将组分分开，而且还要求色谱峰与杂质峰尽量分开。国内外检测硝基咪唑的流动相多采乙腈-水或甲醇-水。本实验尝试甲醇-水、乙腈-水等流动相体系，但峰型不理想，因此选用醋酸氨缓冲液:乙腈比例为86:14 (V/V)，此时杂质峰和溶剂峰在组分出峰时间之前均已出峰，因此这个流动相比例是较为合理的。

5种组分的紫外最大吸收波长略有差异，考虑到色谱峰中杂质干扰问题，紫外检测波长越大杂质干扰越少，经过全波长扫描确定紫外检测波长为320nm。

2.4 线性、重现性、检出限和回收率

配制硝基咪唑类混标的系列标准工作液分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0μg/mL，每一质量浓度重复3次，按上述液相色谱条件分析，测出对应质量浓度的峰面积作标准曲线，得回归方程和相关系数。结果显示，样品浓度在15.0～750.0μg/kg范围内，各组分含量(X)和峰面积(Y)有良好的线性关系，标准校准工作曲线的相关系数均能达到0.99以上。

将标准品配制成质量浓度较低的一组溶液，对每个质量浓度样品测定3次，记录并计算每次测得的信号强度与背景信号强度的均值，以能达到RSN≥3时的样品质量浓度为标准样品溶液的最低检测限，以能达到RSN≥10时样品的质量浓度为标准样品溶液的最低定量限。对罗非鱼空白样品中以1.0μg/kg加标进行实验，各色谱峰明显，计算RSN在11.6～34.3之间。因此把此质量浓度作为最小检出质量浓度。

在10.0g罗非鱼空白样品中加入适量的标准溶液，制备阳性样品。按1.2.4节方法提取净化后液相色谱检测。1d内每一水平重复3个样品，取平均值，计算日内平均回收率及标准相对偏差，结果见表1。

表1 罗非鱼中添加不同水平硝基咪唑类药物的回收率(n=3)Table 1 Recoveries of 5 nitroimidazoles from tilapia muscle at different spike levels (n = 3)

3 结 论

采用固相萃取-高效液相色谱法同时测定罗非鱼肌肉中甲硝唑、地美硝唑、奥硝唑、替硝唑、洛硝哒唑5种残留量，方法检出限均以达到1.0μg/kg。该方法操作方便、灵敏度高、准确度和精密度均可以满足水产品中硝基咪唑类残留检测分析的需要。

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Simultaneous Determination of Nitroimidazoles Multi-residues in Tilapia Muscle by High Performance Liquid Chromatography

WANG Yang，ZHENG Chong-ying，HE Feng，YE Lei-hai
(Aquatic Product Quality Testing Center of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China)

A high-performance liquid chromatography (HPLC) method was developed for the simultaneous analysis of 5 nitroimidazole multi-residues (metronidazole, dimetridazole, ornidazole, tinidazole and ronidazole) in tilapia muscle tissues. Samples were homogenized and extracted by added sodium chloride, monopotassium phosphate and ethyl acetate. Afterwards, the organic phase was recovered and condensed. Finally, the residue was dissolved in hydrochloric acid/ethyl acetate, defatted by liquid-liquid extraction with addedn-hexane, cleaned up on an MCX column by elution with 2% ammonia/methanol, separated chromatographically using acetate buffer solution/acetonitrile (86:14,V/V) as the mobile phase and detected at 320 nm. The results revealed that the limits of detection for 5 nitroimidazoles were all 1.0 μg/kg. The average recoveries for metronidazole, dimetridazole, ornidazole, tinidazole and ronidazole at the spike level of 2.0 μg/kg were 73.3%%, 74.7%, 62.9%, 74.4% and 80.1%, respectively with a RSD of less than 10% (n= 3). This method is simple, sensitive, accurate, precise, and in line with the requirements the Ministry of Agriculture for veterinary drug residue analysis.

solid phase extraction；high performance liquid chromatography (HPLC)；tilapia；nitroimidazoles

TS207.3；O657

A

1002-6630(2011)20-0197-03

2011-02-28

浙江省科技厅水产品加工产业创新团队课题(2011R09031-10)

王扬(1973—)，女，高级工程师，硕士，主要从事水产品营养质量检测和安全评价研究。E-mail：wangyangruanfeng@163.com