高效液相色谱法检测熟肉制品中5种人工合成色素方法的建立

胡汉高，张红菱,*，周 威，李静娜，黄万琪

(1.武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.武汉市疾病预防控制中心，湖北 武汉 430015)

高效液相色谱法检测熟肉制品中5种人工合成色素方法的建立

胡汉高1，张红菱1,*，周 威1，李静娜2，黄万琪1

(1.武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.武汉市疾病预防控制中心，湖北 武汉 430015)

目的：建立一种同时检测熟肉制品中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红5种人工合成色素的方法。方法：熟肉制品经石油醚脱脂、乙醇-氨-水(7:2:1，V/V)超声波振荡提取，聚酰胺粉过滤；采用Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以0.02mol/L乙酸铵和甲醇梯度洗脱，采用二极管阵列检测器在可变波长条件下检测。结果：该方法线性关系良好，相关系数为0.9992～0.9999；5种人工合成色素回收率均在89.6%～96.4%之间，相对标准偏差为1.24%～4.11%。结论：以高效液相色谱法同时检测以上5种人工合成色素，灵敏度高、操作方便、快速、准确度高。

熟肉制品；人工合成色素；高效液相色谱法；二极管阵列检测器

食品着色剂可分为天然色素和人工合成色素两大类，因人工合成色素具有成本低廉、色调多样、色泽亮艳和着色力强等特点，在食品加工业中被广泛采用。因其是由煤焦油中的苯胺为原料制成，所以又称为“煤焦油色素”或“苯胺色素”，属于偶氮类化合物[1]。毒理学研究发现，某些合成色素有慢性毒性或致癌性，使用过量会对人体产生有害作用[2-3]。在我国人工合成色素使用卫生标准中对其使用范围和相应限量均有明确规定，使用范围限于饮料、配制酒、糖果、糕点和青梅等，禁止用于肉类、鱼类、水果及其制品等[4]。目前，国标及文献报道[5-15]的检测方法多是针对这些人工合成色素中的一种或几种，而没有关于这5种人工合成色素在熟肉制品中同时检测的报道，初步工作结果表明，这些色素在熟肉制品中存在一定程度的滥用，如果根据实际任务要求检测这些色素中的一种或几种在食品中的含量，而其中每一种都需分别进行检测。这样不但增加了工作量、延长了工作时间，还降低了工作效率。所以同时检测熟肉制品的这些色素不仅可以提高工作效率，还可以起到筛查的效果，以免漏检。因此建立一种快速准确且能够同时测定熟肉制品中这5种人工合成色素的检测方法，不仅能够为基层食品检测单位提供理论指导，而且能大大提高日常检测的工作效率。本实验采用高效液相色谱法对熟食肉制品中5种人工合成色素进行分离检测，得到了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

各种熟肉制品60件为在武汉市范围内抽取。

1.00mg/mL柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红标准溶液 中国计量科学研究院；混合标准储备液：分别准确吸取1mL各标准溶液于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，得100μg/mL混合标准使用液(4℃保存2个月)；乙醇氨水溶液；乙醇-氨-水(7:2:1，V/V)；酸化甲醇：甲醇-甲酸(6:4，V/V)；甲醇(色谱纯) 美国Tedia公司；所用试剂除特别标注外均为分析纯；水均为超纯水。

600E型高效液相色谱仪、2996型二极管阵列检测器美国Waters公司；KH-600E超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；PT-310电子天平 德国赛多利斯公司；AFX2-1001-P超纯水机 颐洋企业发展有限公司；KDC-1042低速台式离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司；Anke TGL-16B高速离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 样品处理

将样品粉碎混合均匀，称取10g左右(精确至0.01g)置入100mL烧杯中，加海沙少许(约10g)，混合均匀，再加入30mL石油醚，搅拌，超声10min，放置片刻，倾出石油醚，如此重复处理3次，以除去脂肪，用80℃水浴挥尽石油醚后，残渣转移至50mL离心管中，加入乙醇氨水溶液25mL，超声振荡10min，提取色素，3000r/min离心10min，上清液倒入100mL烧杯(不要用滤纸过滤)，残渣继续用乙醇氨水溶液提取，至提取液无明显颜色。合并上清液于100mL烧杯中，用80℃水浴挥至10mL左右(不得挥干)，用20%柠檬酸溶液调pH值至酸性，待用。

1.3 样品净化

将1.2节处理后所得的溶液保持在60～80℃，加入预先用水活化过的自制聚酰胺SPE小柱。用70℃、pH4的柠檬酸溶液淋洗，每次20mL，边洗边搅拌，重复3～4次。再用酸化甲酸溶液淋洗至中性，然后用乙醇氨水溶液洗脱，收集全部洗脱液于100mL烧杯中，用80℃水浴挥至2mL左右(不得挥干)，用水稀释至10mL比色管中定容至10mL刻度。12000r/min离心10min，上清液经0.45μm滤膜过滤，得样品制备液，供高效液相色谱分析用。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相及梯度：A相为0.02mol/L乙酸铵溶液，B相为甲醇，0～2min，95% A→65% A；2～7min，65% A→0% A；7～10min，0% A→95% A；10.1～21min，95% A→95% A；流速：1.0mL/min；柱温：35℃，进样量：10μL。检测器：二级管阵列检测器(PDA)；波长范围：210～60nm。

1.5 标准曲线

将混合标准储备液分别稀释至每毫升相当于1.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg混合标准系列(现用现配)。将混合标准系列溶液，在上述色谱条件下进行测定，以标准系列溶液浓度为横坐标(X)、相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。

1.6 人工合成色素含量计算

混合标准系列溶液与样品制备液按照1.4节色谱条件进行检测，5种人工合成色素与熟肉制品中其他共存物质分离良好，测定不受干扰。计算试样中人工合成色素的含量。

式中：X为样品中人工合成色素含量/(g/kg)；A为样品测定的含量/(μg/mL)；V为样品定容体积/mL；m为样品质量/g。

2 结果与分析

2.1 色谱图及最大吸收波长

高效液相色谱与二极管阵列检测器联用，可绘制出随时间(t)的变化经过检测器样液的光谱吸收曲线-吸光度(A)随波长(K)变化的曲线，因而可由获得的信息绘制出具有三维空间的色谱图，用二极管阵列检测器采集5种人工合成色素在210～600nm波长范围内的光谱图，得到5种人工合成色素的最大吸收波长为柠檬黄420nm、苋菜红520nm、胭脂红510nm、日落黄487nm、诱惑红509nm。在1.4节色谱条件下5种人工合成色素保留时间重现性良好，样品经净化后无明显干扰，其标准溶液、加标样品和空白样品在210～600nm波长范围内的最大值色谱图如图l所示。

图1 各溶液的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of five pigment standards, sample spiked with standards and blank solution

2.2 标准曲线方程的确定

将混合标准系列溶液在1.4节色谱条件下进样分析，以混合标准系列溶液质量浓度为横坐标(X)、其相应的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得以下5种人工合成色素的回归方程、线性范围及相关系数，方法的最低检测限按3倍信噪比计算(表1)。

表1 标准曲线回归方程及相关系数、检测限Table 1 Standard curves, linearity ranges and limit of detections for five artificial pigments

2.3 精密度及加标回收率实验

分别称取10.00g同一混合均匀的样品共8份，其中两份本底，6份分别准确加入500μL 100μg/mL混合标准溶液做加标回收，按照1.2节方法操作，分别定容至10mL比色管，制备液相当于加标质量浓度为5μg/mL，测定空白、加标样品中5种人工合成色素的质量浓度。样品本底为未检出，计算加标平均回收率，每组加标样品测6次，结果见表2。

表2 回收率及精密度实验结果Table 2 Spike recoveries of five pigments and relative standard deviation of 6 repeated determinations

以上验证实验结果RSD值均小于5%，说明精密度良好，平均回收率也较高。所以，证明该处理方法所测得的结果准确可靠，重现性良好。

2.4 熟肉制品中5种人工合成色素的检测

按照1.2节方法测定60件熟肉制品，其中2件卤鸡爪样品中含有柠檬黄，结果为0.063、0.052g/kg。1件卤鸡爪样品中含有柠檬黄和日落黄，结果为0.047、0.016g/kg。1件熟制牛肉样品中含有苋菜红和诱惑红，结果为0.023、0.011g/kg。1件卤猪肉样品中含有胭脂红0.008g/kg。检出率为8.33%。

3 讨 论

3.1 梯度洗脱条件的选择

为了利于色谱峰的分离，选用0.02mol/L乙酸铵溶液与甲醇进行梯度洗脱。最初4min内，如果甲醇体积分数变化过快，柠檬黄和苋菜红不能很好的分离，采用甲醇首先缓慢上升。5min后甲醇快速上升，可以使诱惑红与其他组分既好又快分离，缩短总时间，节约流动相。该梯度使这5种色素得到很好的分离且灵敏度均有一定程度的提高。

3.2 色谱柱平衡时间的确定

采用梯度洗脱进行测定，每次进样之间均需一段时间平衡。本法测定时先用8min时间平衡，5种人工合成色素的保留时间不重现，故将平衡时间增加至11min，5种人工合成色素的保留时间重现性较好。

3.3 样品处理条件的选择

聚酰胺粉SPE小柱为实验室自制，聚酰胺粉SPE小柱外壳为聚乙烯塑料管内装聚酰胺粉，柱长6cm，直径1cm，粉柱两端用无色石英薄板封堵，因为小柱中聚酰胺粉的量有限，在使用时经常会使溶液中色素穿透，所以加入聚酰胺粉的量非常关键，经比较分别加入0.50、0.75、1.00g聚酰胺粉，发现加入0.75g聚酰胺粉能够完全保留目标组分，符合实验需要，且回收率高，测得结果准确可靠。

1.2节中色素经提取后，提取液用水浴锅挥干时，比较将提取液完全挥干和将提取液挥至2mL左右定容，前者定容后色素溶解不完全，严重影响回收率，而后者确保了良好的回收率。

3.4 测定方法的选择

国标方法GB/T 5009.141—2003《食品中诱惑红的测定》为纸层析-分光光度法[16]，该标准方法步骤繁琐复杂，检出限为25mg/kg，灵敏度低。本方法为液相色谱法，检出限为0.10mg/kg，灵敏度更高。而且与柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄4种常用人工合成色素同时检测，结果准确可靠、重现性良好、灵敏度高，大量节约了检测时间和试剂成本从而提高了工作效率。为日常食品检测工作提供了良好的指导意义。

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Development of an HPLC Method for Determination of Five Artifical Food Pigment in Cooked Meat Products

HU Han-gao1，ZHANG Hong-ling1,*，ZHOU Wei1，LI Jing-na2，HUANG Wan-qi1
(1. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. Wuhan Diseases Control and Prevention Center, Wuhan 430015, China)

Objective: To establish an HPLC method for simultaneous determination of five artificial pigments (lemon yellow,amaranth, carmine, sunset yellow and fancy red) in cooked meat products. Methods: Cooked meat products were defatted by petroleum ether, and extracted by ethanol/ammonia/water solution (7:2:1,V/V) with the assistance of ultrasound. The resultant extract was treated using a polyamide SPE cartridge. The pigments were separated on an Eclipse XDB-C18 column (5μm, 4.6 mm ×250 mm) by gradient elution with a mobile phases made up of 0.02 mol/L NH4Ac and methanol, and detected by a DAD detector at alterable wavelength. Results: The established method displayed good linearity with correlation coefficient between 0.9992 and 0.9999. The recoveries of the five pigments ranged between 89.6% and 96.4% with a relative standard deviation (RSD)between 1.24% and 4.11%.Conclusions: This method is sensitive, simple, rapid and accurate, and can be used for simultaneous determination of the five artificial pigments in cooked meat products.

meat products；artificial pigment；high performance liquid chromatography (HPLC)；diode array detector(DAD)

TS207.3

A

1002-6630(2011)20-0171-04

2010-12-22

胡汉高(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为卫生检验。E-mail：hhg1957@163.com

*通信作者：张红菱(1965—)，女，教授，硕士，研究方向为卫生检验。E-mail：zhlwjb@sina.com