葡萄籽中原花青素提取工艺

肖丽霞，何志贵,3，朱 勇，曾庆文，胡博然,*

(1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225000；2.扬州大学生物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；3.桂林旅游高等专学校，广西 桂林 541006)

葡萄籽中原花青素提取工艺

肖丽霞1，何志贵1,3，朱 勇2，曾庆文1，胡博然1,*

(1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225000；2.扬州大学生物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；3.桂林旅游高等专学校，广西 桂林 541006)

以发酵后葡萄籽为原料，研究微波、纤维素酶和超声波辅助提取葡萄籽中原花青素的工艺条件，对影响原花青素提取率的因素进行考察，通过正交试验确定葡萄籽中原花青素的最佳提取工艺。结果表明最佳方法为微波辅助提取，其最佳工艺条件：料液比1:25(g/mL)、乙醇体积分数80%、微波时间40s、微波功率115W，原花青素的提取率为10.70%。

葡萄籽；原花青素；微波；酶解；超声波

原花青素是从葡萄籽中提取出来的多酚类黄酮，主要是以儿茶素或表儿茶素为单体缩合而成的聚合物，还含有少量的儿茶素和表儿茶素、咖啡酸等有机酸，它们以复杂成分和协同方式起抗氧化作用，使其具有高度的生物利用度。原花青素具有多种药理活性，如抗氧化、清除自由基、护肝解毒、抗菌及抗癌等功能[1-6]。

随着我国葡萄酒业的发展，葡萄籽作为葡萄酒工业中的副产品也逐年增加。目前国内对葡萄籽的综合利用还比较低，只是简单地提取葡萄籽油或者是被用来当作饲料使用。将葡萄籽中的活性成分进行提取利用，能使葡萄籽得到充分利用，同时还能提高葡萄酒加工企业的经济效益[7-8]。

微波萃取是近年才发展起来的一门新技术，最大的特点是作用时间短，提取效率高，有效成功破坏小，节约能量等[9-11]。超声波被广泛应用于中草药有效成分的提取分离，由于这种技术具有快速、能耗低、提取率高的特点[12-14]，受到越来越多的关注。高等植物细胞壁具有一定硬度和弹性的固体结构，主要由纤维素形成其网状框架，因此可以使用纤维素酶降解纤维素，使细胞壁等结构疏松瓦解，从而提高有效成分的提取率[15-16]，具有条件温和、节约能源、提取率高、除杂等优点。

本实验采用微波、纤维素酶和超声波辅助提取3种方法对葡萄籽中原花青素的提取工艺进行研究，最终确定最适宜的提取方法及工艺条件，为葡萄籽中原花青素的提取和开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄籽由江苏太仓产地的酿酒葡萄赤霞珠经发酵后，过滤去皮获得。

儿茶素标准品 南京泽郎医药科技有限公司；纤维素酶 上海蓝季科技发展有限公司；香草醛 医药集团 上海化学试剂公司；浓硫酸 中国恒利试剂厂出品；无水乙醇 西陇化工股份有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

V-1600PC分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；FW135型粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；RE52-4型旋转蒸发仪 上海沪西分析仪器有限公司；DL-120B型超声波清洗器 上海三信仪器有限公司；TG16A-WS型离心机 卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

将葡萄籽30℃烘干、粉碎，用石油醚浸泡48h，抽滤，烘干备用。

1.3.2 原花青素标准曲线绘制

采用硫酸-香草醛法[17]。精确称取儿茶素标准品配制成1.0mg/mL对照品标准溶液，分别取0、2、4、6、8mL定容到10mL，再各取0.5mL，依次加入2.5mL 30g/L的香草醛-甲醇溶液和2.5mL 30%浓硫酸-甲醇溶液，摇匀后于30℃水浴避光反应30min，然后测定A500nm，绘制标准曲线，回归方程为：y＝0.5839x－0.0071(式中，y为吸光度，x为儿茶素质量浓度，R2＝0.9990)。

1.3.3 葡萄籽中原花青素的提取及测定

准确称取葡萄籽粉1.0g，在一定条件下进行提取，合并滤液，减压浓缩，回收乙醇，定容后得原花青素提取液。吸取0.5mL原花青素提取液，按照标准曲线方法测定原花青素质量浓度，每样做平行3次，计算原花青素提取率。

式中：PC为样品中原花青素提取率/%；X为根据标准曲线计算得的样品中原花青素质量浓度/(mg/mL)；V1为取样体积/mL；V2为定容后样品总体积/mL；m为原料质量/g。

1.3.4 试验设计

研究微波、纤维素酶和超声波辅助3种方法提取葡萄籽中原花青素的工艺条件，对影响原花青素提取率的因素进行考察，通过单因素及正交试验确定葡萄籽中原花青素的最佳提取工艺。比较3种方法的优劣，确定最佳提取工艺。

2 结果与分析

2.1 微波辅助提取葡萄籽中原花青素试验

图1 各因素对微波辅助提取葡萄籽中原花青素的影响Fig.1 Effects of various microwave-assisted extraction parameters on extraction rate of proanthocyanidins

2.1.1 料液比对提取率的影响

如图1a所示，在其他条件一定的情况下，原花青素提取率随着提取液用量增加而增加，当料液比为1:20时，提取率达到8.02%，随着提取液用量的进一步加大，其提取率有所降低。因此，选择1:20为最佳料液比。

2.1.2 乙醇体积分数对提取率的影响

如图1b所示，当乙醇体积分数达到70%时，原花青素的提取率达到最高值7.3%。因为乙醇体积分数较低时，水的含量相应较高，则原花青素提取率会降低；而当乙醇体积分数过高时脂溶性物质容易溶出，从而降低原花青素的提取率。因此，选择70%为最佳乙醇体积分数。

2.1.3 微波时间对提取率的影响

如图1c所示，微波作用时间越长，原花青素提取率越高，微波超过50s后，提取率呈下降趋势，这是由于随着时间的增加，料液温度升高，使得热稳定性较差的原花青素被破坏。因此，选择50s作为最佳提取时间。

2.1.4 微波功率对提取率的影响

如图1d所示，随着微波功率的增加，提取物加热的速度加快，原花青素越容易被提取出来，当微波功率在115W时，提取率达到最大为7.85%。随着微波功率的进一步加大，提取率急剧降低，因为微波功率过大使得温度过高，原花青素损失越多。此外，在较高功率下乙醇溶液容易沸腾以至冲出三角瓶，影响试验结果。因此，选择115W为最佳提取功率。

2.1.5 提取次数对提取率的影响

葡萄籽经一次提取后，其中的有效成分不会立即提取完全，为考察原花青素经过多次提取后，原花青素的含量变化情况及工作需要，采用同样的步骤，对一定量的葡萄籽进行多次提取实验。如图1e所示，经过两次提取后，葡萄籽中的原花青素得率均在2%以上，3次提取时原花青素得率则较低，两次提取较为合理。

2.1.6 葡萄籽中原花青素微波提取正交试验

根据以上分析，在两次提取的情况下，对影响原花青素提取率主要因素料液比、乙醇体积分数、微波时间、微波功率进行L9(34)正交试验，研究这些因素对葡萄籽原花青素提取率的影响，因素水平见表1。

表1 微波辅助提取葡萄籽中原花青素正交试验因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design for optimizing microwave-assisted proanthocyanidins extraction

表2 微波辅助提取葡萄籽中原花青素正交试验结果与分析(n=3)Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimizing microwave-assisted proanthocyanidins extraction(n=3)

由表2可知，影响原花青素提取效果各因素为料液比＞微波功率＞微波时间＞乙醇体积分数，料液比对提取率影响最大，乙醇体积分数对提取率影响最小；最佳提取条件组合为A3B3C1D2，即乙醇体积分数8 0%、料液比1:2 5、微波时间4 0 s、微波功率115W。在最佳条件下进行验证实验，得到原花青素提取率为10.70%，高于各试验组，说明正交试验优化结果可靠。

2.2 纤维素酶辅助提取葡萄籽中原花青素试验

图2 各因素对纤维素酶辅助提取原花青素的影响Fig.2 Effects of various cellulase hydrolysis-based extraction parameters on extraction rate of proanthocyanidins

2.2.1 酶添加量对提取率的影响

如图2a所示，酶添加量在300U/mg时，原花青素的提取率最高。酶添加量过低时，酶未被底物饱和；酶添加量较高时，可能由于溶液中的抑制剂与酶结合导致酶活降低。因此，选择300U/mg为最佳酶添加量。

2.2.2 酶解时间对提取率的影响

如图2b所示，酶和底物作用的时间对原花青素提取率的作用并不明显。开始作用时，随着时间的延长，提取率也相对升高，作用时间为1.5h时达到最高，之后随着时间的增加，提取率呈下降趋势。可能原因是：时间较短，酶与底物反应不完全，原花青素还没有完全溶出，时间较长，原花青素已大部分溶出，且随着在空气中暴露的时间增加，发生氧化损失，所以含量呈下降趋势。因此，选择1.5h为最佳提取时间。

2.2.3 pH值对提取率的影响

酶活性的发挥与它所处的pH值环境有关，过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性受到抑制或丧失。如图2c所示，pH4时，原花青素的提取率最高。综合考虑，选择最适pH4。

2.2.4 酶解温度对提取率的影响

如图2d所示，随着温度的升高，原花青素的提取率逐渐升高，50℃时达到最高，超过50℃后，随着温度的升高，原花青素的提取率降低，可见50℃是该反应条件下纤维素酶的最适温度，故选50℃为最佳提取温度。2.2.5 酶法辅助提取葡萄籽中原花青素正交试验

根据以上的分析，在两次提取的情况下，对影响原花青素提取率的主要因素酶添加量、酶解时间、pH值、酶解温度进行L9(34)正交试验，研究这些因素对葡萄籽原花青素提取率的影响，因素水平见表3。

表3 纤维素酶辅助提取葡萄籽中原花青素正交试验因素水平表Table 3 Factors and their coded levels in orthogonal array design for optimizing cellulase hydrolysis-based proanthocyanidins extraction

表4 纤维素酶辅助提取葡萄籽中原花青素的正交试验结果与分析 (n=3)Table 4 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimizing cellulase hydrolysis-based proanthocyanidins extraction (n=3)

由表4可知：影响原花青素提取效果各因素为酶解温度＞pH值＞酶解时间＞纤维素酶添加量；最佳组合为A1B1C1D1，即纤维素酶添加量100U/mg、酶解时间1.0h、pH4.0、酶解温度45℃。在最佳条件下进行验证实验，得到原花青素提取率8.75%，说明正交试验优化结果可靠。

2.3 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素试验

图3 各因素对超声波辅助提取葡萄籽中原花青素的影响Fig.3 Effects of various ultrasonic-assisted extraction parameters on extraction rate of proanthocyanidins

2.3.1 乙醇体积分数对提取率的影响

如图3a所示，原花青素的提取率随着乙醇体积分数的增加而增加，乙醇体积分数达到60%时，原花青素的提取率最高达到2.61%，之后随着乙醇体积分数增加，原花青素的提取率下降。其原因可能是：当乙醇体积分数较高时，溶出的醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分增加，它们同原花青素竞争与乙醇-水分子结合，同时植物组织的通透性下降，都会导致原花青素的提取率降低。因此，确定60%为最佳乙醇体积分数。

2.3.2 料液比对提取率的影响

如图3b所示，随着提取液的增加，原花青素的提取率增大，但达到一定程度后，再增大料液比，提取率趋于稳定。这是因为溶剂用量达到一定程度后，葡萄籽中原花青素已经基本全部溶出，再增加溶剂的用量不仅造成不必要的浪费，而且还给后续加工增加麻烦。因此，提取液的用量不宜太大，故选择1:30作为最佳料液比。

2.3.3 超声温度对提取率的影响

原花青素的提取率与提取温度密切相关，一般来说，冷提杂质少；热提效率高，但是杂质也相对较多。确定一个适宜的温度不仅可以增加提取率，而且还有利于原花青素的纯化。如图3c所示，随着温度的升高，原花青素的提取率也随之增加，但当超过一定值后，随着温度的升高，提取率却有所下降。这是因为原花青素热稳定性较差，过高的温度不仅会使原花青素发生聚合氧化，而且会使提取的杂质含量增加。因此，选择45℃为最佳提取温度。

2.3.4 超声时间对提取率的影响

如图3d所示，随着超声波处理时间的延长，原花青素的提取率逐渐提高，但当超过25min时，原花青素的提取率有所下降。这主要是因为原花青素长时间受热部分结构被破坏，造成提取率下降。因此，选择25min作为最佳提取时间。

2.3.5 超声功率对提取率的影响

如图3e所示，超声波功率增加，原花青素的提取率也增加，在达到80W后，原花青素的提取率反而下降。功率增大有利于原花青素的提取，但是功率过大则会产生大量的热量使得原花青素的结构被破坏。

2.3.6 提取次数对提取率的影响

考虑到葡萄籽经一次提取，其中的有效成分不会提取完全，采用同样的步骤，对一定量的葡萄籽进行多次提取实验，由图3f可知：3次提取时，原花青素提取率很低，从工作量、生产成本等因素考虑，两次提取较为合理。2.3.7 葡萄籽中原花青素超声波提取正交试验

表5 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素正交试验因素水平Table 5 Factors and their coded levels in orthogonal array design for optimizing ultraonic-assisted proanthocyanidins extraction

表6 超声波辅助提取原花青素的正交试验设计及结果(n=3)Table 6 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimizing ultrasonic-assisted proanthocyanidins extraction(n=3)

根据单因素试验结果，可以得出原花青素提取率的主要影响因素为乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率。超声温度影响较小，不予考虑，选定温度45℃。在两次提取的情况下，以乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率4因素进行正交试验，选择L9(34)正交表进行试验，因素水平见表5。

由表6可知：影响原花青素提取效果各因素为超声时间＞料液比＞超声波功率＞乙醇体积分数；得出最佳提取条件组合为A1B3C3D2，即乙醇体积分数50%、料液比1:35、超声时间30min、超声波功率80W。在最佳条件下进行验证实验，原花青素提取率为5.57%，高于各试验组，说明正交试验优化结果可靠。

3 结 论

通过比较微波、纤维素酶和超声波辅助提取葡萄籽中原花青素的提取工艺，发现微波辅助提取优于其他两种方法。从提取时间来看，微波法能明显缩短提取时间，提取时间远小于其他两种方法，微波提取仅需40s，而其他两种方法都需时间较长；从原花青素提取率来看，微波法与纤维素酶法、超声波法相比，分别提高22.3%、92.1%。综合以上因素，葡萄籽中原花青素最佳方法为微波法，最优工艺为乙醇体积分数80%、料液比1:25、微波时间40s、微波功率115W，原花青素提取率为10.70%。

本研究为葡萄籽中原花青素的提取与开发利用提供了实验依据，为葡萄籽中原花青素的开发利用提供了参考。

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Optimization of Proanthocyanidin Extraction from Grape Seed

XIAO Li-xia1，HE Zhi-gui1,3，ZHU Yong2，ZENG Qing-wen1，HU Bo-ran1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；2. College of Biological Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；3.Guilin Institute of Tourism, Guilin 541006, China)

The aim of this study was to optimize technical conditions for ultrasonic-assisted ethanol extraction, cellulase hydrolysis-based extraction and microwave-assisted ethanol extraction of proanthocyanidins from grape seed power using onefactor-at-a-time coupled with orthogonal array design method. Microwave-assisted extraction was found to be the best of the three methods, and the optimal process conditions were ethanol concentration of 80%, material-to-liquid ratio of 1:25 (g/mL),microwave treatment time of 40 s and microwave power of 115 W. Under these conditions, the extraction rate of proanthocyanidins was 10.70%.

grape seed；proanthocyanidins；microwave；cellulose；ultrasonic

R284.2

A

1002-6630(2011)20-0089-06

2011-05-31

海南省重点科技项目(070121；ZDXM20100005)

肖丽霞(1966—)，女，副教授，博士，研究方向为农产品贮藏加工。E-mail：lxxiao@yzu.edu.cn

*通信作者：胡博然(19 64—)，女，教授，博士，研究方向为葡萄酒、食品生物技术、食品安全。E-mail：huboran2001@yahoo.com.cn