合成红藻氨酸诱发大鼠癫痫作用的研究

许 华， 张 洁， 喻 静

(1暨南大学药学院，广东 广州 510632；2太原市妇幼保健院药剂科，山西 太原 030012；3广州市质量监督检测研究院，广东 广州 510110)

·实验技术·

合成红藻氨酸诱发大鼠癫痫作用的研究

许 华1△， 张 洁2， 喻 静3

(1暨南大学药学院，广东 广州 510632；2太原市妇幼保健院药剂科，山西 太原 030012；3广州市质量监督检测研究院，广东 广州 510110)

目的观察合成红藻氨酸(SKA) 诱发大鼠癫痫的作用及其作用特点。方法Wistar大鼠40只，随机分为正常对照组、SKA 12 mg/kg、SKA 10 mg/kg 和 SKA 5 mg/kg 剂量组及红藻氨酸 (KA)10 mg/kg阳性对照组。腹腔注射给药，连续8 h观察大鼠癫痫发作的行为学变化及连续3.5 h记录其脑电图变化。结果合成红藻氨酸5、10、12 mg/kg 腹腔注射，可诱发大鼠癫痫发作，其行为学及脑电改变与KA对照组无明显差异。但合成红藻氨酸诱发动物癫痫呈现规律、稳定及阶段性明显的特征，且大鼠的死亡率较天然红藻氨酸低。结论合成红藻氨酸腹腔注射可诱发大鼠癫痫发作，以10 mg/kg为较合适剂量。

合成红藻氨酸； 模型，癫痫

红藻氨酸(kainic acid， KA)是红海藻海人草(Digeneasimplex)提取物，化学名为2-羧基-3羧甲基-4异丙烯基吡咯烷，与谷氨酸(glutamic acid,Glu)结构相似，可作用于脊椎动物中枢神经系统的Glu受体，既可直接兴奋神经元，又可增强钠离子的通透性而使神经细胞去极化，诱发癫痫的发生[1]。目前KA已作为癫痫急、慢性造模剂，广泛应用于癫痫的病理生理学研究及抗癫痫药物筛选等研究中[2-5]。本文观察了KA的人工合成品，即合成红藻氨酸(synthetical kainic acid，SKA)是否具有诱发大鼠癫痫的作用，并观察了其诱发癫痫的作用特点。

材 料 和 方 法

1药品

SKA由广州诺东生物科技有限公司提供，白色针状晶体，分子式：C10H15NO4·H2O。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)检测结果显示，其分子量为231.2，纯度大于99%，批号为nd000700312。临用时用生理盐水配制成所需浓度，按5 mL/kg BW腹腔注射给药。对照品KA购自Sigma，批号为086K1524，配制方法同SKA。

2动物

SPF级Wistar成年健康大鼠，雌雄各半，体重(192±22)g，购于第一军医大学实验动物中心，合格证号为0027687。大鼠自由饮食饮水，实验前在室温(24±2)℃实验室适应性饲养1周。

3分组及剂量设计

已有大量用天然提取物红藻氨酸诱发大鼠癫痫的研究报道，其对大鼠腹腔注射常用剂量为10 mg/kg[6-8]。本试验设计SKA 12 mg/kg、10 mg/kg和5 mg/kg 3个剂量组进行实验，同时设立KA(10 mg/kg)阳性对照组和正常(生理盐水)对照组。

4方法

4.1行为学观察 大鼠40只，随机分为5个组，每组8只，分别为正常对照组、SKA组高、中、低剂量组(分别为12 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg)和KA阳性对照组(剂量10 mg/kg)。均于上午9时左右腹腔注射给药。用药后观察不同组别大鼠8 h内癫痫发作情况如潜伏期、发作级别、发作持续时间、发作次数等行为学变化。行为学表现分级参照文献标准[9]：Ⅰ级：凝视等；Ⅱ级：I级+节律性点头；Ⅲ级：II级+双侧前肢阵挛；Ⅳ级：III级+后肢站立；Ⅴ级：IV级+摔倒/四肢抽搐，并计数24 h内各组动物的死亡数。

4.2脑电图观察 另设24只大鼠，分为3组，即正常对照组、SKA 10 mg/kg组和KA 10 mg/kg组。乙醚麻醉大鼠，使其俯卧位固定于脑立体定位仪上，待其清醒约10 min后进行脑电监测。应用BL-420脑电监测系统对大鼠进行脑电波记录。采用头皮电极，在大鼠双侧颞部头皮处各插入1根针电极，参考电极插入鼻尖部，组成2个导联：(1) T1：左颞叶-参考电极；(2) T2：右颞叶-参考电极[10]。准备工作完毕后，先观察5-10 min，待大鼠适应脑立体定位仪并波形稳定后开始给药并计时，连续3.5 h监测脑电变化及相应行为改变。

5统计学处理

结 果

1SKA引起的大鼠癫痫样发作行为学变化

腹腔注射10 mg/kg SKA后约5 min，大鼠出现凝视行为(Ⅰ级)，继之分别在约23 min、97 min、140 min和129 min动物顺序出现Ⅱ-Ⅴ级癫痫发作。约43 min后出现“湿狗样” 抖身(WDS)。每次发作时间为2-10 s，发作间期动物呈呆滞不动或燥动不安。反复发作3-4 h后动物症状开始减轻，7-8 h 发作基本停止，此后动物呈衰竭状态而呆滞不动；14 h后基本恢复正常。其它剂量组动物行为学改变详见表1-5。SKA(10 mg/kg)组死亡率为0，而同剂量KA组为37%。

表1SKA诱发癫痫发作不同级别的动物数

GroupThegradesofepilepticseizure(n)ⅠⅡⅢⅣⅤNormalcontrol00000SKA(12mg/kg)8/88/88/88/88/8SKA(10mg/kg)8/88/88/84/81/8SKA(5mg/kg)5/55/55/50/50/5KA(10mg/kg)8/88/85/85/82/8

表2 SKA诱发癫痫发作不同级别潜伏期

*P<0.05vsKA (10 mg/kg) group;nsee table 1.

表3 SKA诱发癫痫发作不同阶段的持续时间

The persistence time means the longest time at different grades.*P<0.05,**P<0.01vsKA (10 mg/kg) group;nsee table 1.

表4 SKA诱发癫痫发作不同级别特征性动作的次数

The frequency of Ⅰ, Ⅱand Ⅲ grades means the total numbers which were recorded before the characteristic behaviors of next grade appeared. The frequency of Ⅳ or Ⅴ grade indicates the total number of the characteristic behaviors in Ⅰto Ⅴ grade.△P>0.05vsKA (10 mg/kg) group.nsee table 1.

表5各组大鼠湿狗样抖动(wet-dogshake)表现

GroupLatency(min)Persistencetime(min)TotalnumberMaximumnumberin1minNormalcontrol0000SKA(12mg/kg)43.38±8.4746.25±12.1722.13±7.383.50±1.41SKA(10mg/kg)44.75±11.83△58.14±27.20△23.88±12.86△5.00±2.98△SKA(5mg/kg)18.67±7.57136.67±90.7326.33±14.054.33±2.08KA(10mg/kg)42.40±2.3048.57±28.8024.00±8.944.60±0.89

△P>0.05vsKA (10 mg/kg) group.nsee table 1.

2SKA用药后大鼠脑电的变化

正常大鼠脑电图波幅低，大概在10 μV左右波动，节律平稳，频率约110 Hz左右，见图1。注药后至癫痫发作时间段内，脑电波形无明显改变。当大鼠出现抽搐等癫痫行为时，可见典型的高幅棘波(图2)，但频率改变不明显。继之出现尖波和尖慢叠加波，并可观察到大鼠一些相伴行的行为表现，如竖尾(图3)、剧烈甩尾(图4)等。

讨 论

KA由Murakami等于1953年从红海藻中提取，最初主要用途为驱虫剂，后用于模拟脑退变的研究。但其价格可高达每10 mg 约200余美元，使得不少研究者不得已采用一些模拟脑退变效果并不显著、但可以减少其研究费用的其它造模剂。近年来一些药学家开始致力于红藻氨酸的研制，如在具备海水的暖房内种植海藻然后生产红藻氨酸，或仍以传统的海人草作原料提取红藻氨酸。本文研究了一种完全合成的红藻氨酸诱发大鼠癫痫发作的作用。

1合成红藻氨酸(SKA)所致大鼠癫痫急性发作特点

1.1癫痫阶段性发作特征[11,12]I级发作：大鼠注射SKA后，均迅速出现呼吸急促、弓背、竖毛等状态，约4 min大多动物进入抑制状态，表现为静伏少动、眼神呆滞，此期内可出现凝视(Ⅰ级特征)、眼裂变大、双眼球突出及颜面肌轻微抽搐。II级发作：注射SKA后约23 min，在Ⅰ级基础上出现节律性的点头(Ⅱ级特征)，平均1.5次/秒；此期可见大鼠尾硬，甚或垂直竖起，发作完毕缓解变软。Ⅲ级发作：注射SKA后约98 min，在Ⅱ级发作的基础上，动物出现双侧前肢阵挛(Ⅲ级特征)，完毕后动物可正常活动一段时间后，再次发生阵挛，2-3次之后出现双侧前肢阵挛伴后肢站立(IV级)状态。IV级发作：注药后1-3.5 h，动物出现双侧前肢阵挛伴后肢站立(IV级特征)，可在较短时间内连续出现；有时观察不到单独的III级，有时IV级在III级之前，III级IV级经常交替出现，界限模糊。Ⅴ级发作：Ⅴ级是在Ⅳ级基础上的大发作，可见大鼠后肢竖直立起，向一侧或向后翻倒，或摔倒后快速爬起，有些则是摔倒后保持侧卧并四肢抽搐，连续抽或仅抽动1次。在Ⅳ级-Ⅴ级之前均伴有明显的咀嚼和眨眼，甚至可听到牙齿碰击的声音，并大量流涎，或口吐白沫；眨眼状态频度甚快，甚至呈现似闭眼或半闭眼状态，多为单只眼表现。闭眼与咀嚼同时进行，是动物进入IV-V级的先兆。

Figure 1. Normal electroencephalogram in rats showed that the wave amplitude fluctuated at 10 μV and the frequency was 110 to 120 Hz.

图1大鼠正常脑电图

Figure 2. The rat’s electroencephalogram recorded at 96 min after SKA (10mg/kg) injection showed that the amplitude evidently increased. Meanwhile the rat had convulsion, corresponding to Ⅲ grade epileptic seizure.

图2SKA10mg/kg注药后96min脑电图

Figure 3. The rat’s electroencephalogram recorded at 132 min after SKA (10mg/kg) injection showed that the fused-wave appeared. Meanwhile the rat’s tail reared, corresponding to IV grade epileptic seizure.

图3SKA10mg/kg注药后132min脑电图

Figure 4. The rat’s electroencephalogram recorded at 137 min after SKA (10mg/kg) injection showed that many independent waves were confluent. Meanwhile the rat was gravis tail-flicked,corresponding to V grade epileptic seizure.

图4SKA10mg/kg注药后137min大鼠脑电图

1.2癫痫发作的某些特殊行为 (1)转圈行为和扭身动作：大鼠在近Ⅲ级发作之前，在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级发作间期和V级发作之后的缓解期，会出现以尾部为中心或以一定半径朝同一方向进行的转圈行为，时快时慢，多持续较长时间。另外，尚可见动物出现扭身动作-大鼠保持臀部坐立姿势，头向后下扭向尾根，甚或吸咬尾根，有时身体扭曲过度进而摔倒。(2)拍击地面、身体挪移或弓背倒退行走：除经典的Ⅳ级、Ⅴ级症状外，在Ⅲ级发作之后动物还会出现如下几种状态：a、双前肢或四肢同时拍击地面。如是四肢同时拍击，动物趴位并弓背，似轻微蹦起。b、大鼠坐位，双前肢向前推地身体向后顿挫性挪移。c、动物弓背低头倒退行走。(3)其它症状：有些动物虽没有出现典型的Ⅳ、Ⅴ级症状，但出现身体竖立、向上剧烈窜跳，跳起时左右乱撞，力度大、发作猛，跳跃完毕后大鼠摔落瘫软在地，这也是大发作的一种表现，可归为大发作。值得注意的是本实验中“湿狗样”抖动(WDS)这一癫痫经典动作是在看到明显的节律性点头(Ⅱ级)之后才出现的，紧接着才是Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级的连续发作，并且WDS动作持续时间较长，发作频繁，并非像使用天然提取KA造模的大量文献所述，即WDS是癫痫发作的前驱动作，甚至有些分级标准将其归入Ⅰ级，与本次实验结果不相符。

大发作完毕后，大鼠瘫软在地，时间长短不一，少数动物在8 h内可恢复正常，大部分则不能，个别动物一直处于转圈状态。只能诱发到Ⅲ级发作的大鼠在Ⅲ级发作后表现为频繁的搓脸洗澡动作，或采用直立坐姿，头部低垂，双前肢有节律的揉搓下腹部。8 h内死亡的大鼠，在死亡之前都会出现1次大发作，以身体纵轴为轴线，从地面旋转着向空中上升，大约离地1-3 cm高度短暂停留空中，旋转1或者2圈后落下，此时动物已近死亡状态。检查死亡大鼠，有些可见口鼻部有血沫，或前后肢指趾有血迹或出现血泪症。

2SKA所致大鼠癫痫脑电图及其特点

发生特征性癫痫行为同时的脑电图均可见若干个独立波形合并，有些甚至偏离基线，波形极不规则。待癫痫缓解时，此特殊波形消失，并迅速恢复正常波形。SKA与KA相应时间段脑电波形相似。由于大鼠固定于脑立体定位仪上，判断其是否进入典型癫痫状态最可靠易行的方法是观察大鼠的尾部变化。发作初期，大鼠尾僵硬，似棍状，随后垂直竖起，以尾根部为圆心垂直于身体做圆周动作，即“甩尾”，几乎出现在整个发作期，仅速度和尾硬程度不同。在发作前或发作过后缓解期，几分钟到十几分钟不等发生1次甩尾动作，缓慢旋转。偶见抽搐，但并未观察到单独的肢体阵挛。在整个发作期可见大鼠背毛竖起。在出现上述行为表现时，大鼠脑电波形并未呈现明显规律性变化，其频率和正常状态无明显差异，但波幅大多明显增高。

总之，合成红藻氨酸诱发大鼠癫痫作用的结果显示，SKA 5-12 mg/kg腹腔注射可诱发大鼠癫痫发作，以10 mg/kg剂量为佳。其诱发大鼠癫痫发作的行为学特征及脑电改变与天然红藻氨酸对照组无明显差异，但合成红藻氨酸诱发大鼠癫痫发作的阶段性明显、行为学表现规律、稳定，死亡率亦较低，原因可能与其纯度较高有关。

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Synthetickainateacidinducesseizuresinrats

XU Hua1, ZHANG Jie2, YU Jing3

(1PharmacyCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2MaternalandChildHealthHospitalofTaiyuan,Taiyuan030012,China;3GuangzhouQualitySupervisionandTestingInstitute,Guangzhou510110,China.E-mail:huax-mail@163.com)

AIM: To observe the effect of synthetical kainic acid (SKA) on inducing epileptic seizure in rats.METHODSForty Wistar rats were divided into normal control group, 5 mg/kg, 10 mg/kg and 12 mg/kg SKA-treated groups and kainic acid (KA) positive control group. The SKA was injected intraperitoneally. The changes of the epileptic behaviors were observed for 8 h successively and the electroencephalography was recorded for 3.5 h.RESULTSSKA induced epileptic seizures at the dose of 5-12 mg/kg by intraperitoneal injection. No apparently difference between SKA and KA on the changes of epileptic behaviors or electroencephalography was observed. However, the epileptic seizure induced by SKA showed obvious stages, regular pattern and action steady. In addition, SKA caused lower fatality than KA did.CONCLUSIONSKA induces epileptic seizure in rats and the dose of 10 mg/kg by intraperitoneal injection is the optimal.

Synthetic kainate acid; Models,epilepsy

R742.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.041

1000-4718(2011)01-0204-05

2010-07-28

2010-10-19

△通讯作者 Tel: 020-85224766; E-mail:huax-mail@163.com