微生物能力验证样品制备工艺及水产品企业水平测试结果评价

周向阳，王淑娜，鄢建辉，沈 飚，胡兴娟，朱炳林

（1.舟山出入境检验检疫局，浙江舟山 316000；2.杭州市原种场，浙江杭州 311115；3.浙江大学动物预防医学研究所，浙江杭州 310029）

能力验证是实验室外部质量控制的有效措施之一，也是计量认证和实验室认可的必备要求。水产品企业实验室的微生物检验能力不仅关系着出口企业的经济效益，也将影响到水产品的卫生与安全。为了进一步提高舟山市水产品企业微生物检验的工作质量，舟山出入境检验检疫局科技认证处与舟山检科分院合作，根据该巿检验检疫工作的特点和水产品待检项目的要求，选取了3个常规的检测项目，即菌落总数、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌检测，于2009年对该巿88家水产品企业开展实验室检测能力验证。

目前，微生物学检验领域尚无高可信度、高通量的微能力验证制备技术，且在菌落总数的检测项目上无标准菌株，这些微生物检验中的不确定性因素，使得实验室间能力验证的可信度打折[1]。同时，部分商品化的微生物能力验证样品价格比较昂贵，也不能完全符合某地区某类型水平测试的特点。有研究认为，冷冻干燥技术保存微生物可以维持细菌生物学特性，且样品也易于保存和运输，其在微生物能力验证样品的制备方面有良好应用前景[2]。因此，笔者探索并采用冷冻干燥技术制备了一批副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌检测以及菌落计数的微生物能力验证样品，在对水产品企业实验室进行检验水平测试的同时，也给这些企业实验室检测水平的进一步提高提供了建议。

1 材料与方法

1.1 微生物菌株

副溶血弧菌（VP）、拟态弧菌（VM）由浙江大学动物预防医学研究所提供；金黄色葡萄球菌（SA）、表皮葡萄球菌（SE）由舟山出入境检验检疫局水产品实验室保存。

1.2 试剂与仪器

所用试剂有脱脂奶粉、甘油、NaCl、BHI培养基、TCBS琼脂、Baird-Park琼脂、冷冻保存液A（含8%奶粉、4%甘油、0.3%NaCl）、冷冻保存液B（含8%奶粉、4%甘油）等；主要仪器有生化培养箱、超净工作台、普通冷冻离心机、酶标仪、冷冻干燥机、低温冰箱、超低温冰箱等。

1.3 能力验证样品的制备方法

1.3.1 细菌的培养

副溶血弧菌、拟态弧菌在含3%NaCl的BHI培养基中培养5 h左右，2 000 r/min离心10 min，沉淀用冷冻保存液A混悬均匀，并调整OD600至0.3，两菌等量混合后进行10倍梯度稀释。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌在BHI培养基中培养至对数生长期，离心后用冷冻保存液B混悬，调整OD600为0.4，等量混合并进行梯度稀释。另外，取部分金黄色葡萄球菌混悬液，稀释至合适浓度进行菌落总数的测定。

1.3.2 制备工艺

将调整好浓度的细菌混合/悬液分装至安瓶，每瓶1mL；安瓶放于-20℃低温预先冻结1 h，立即转至-80℃超低温冰箱冷冻12 h左右；提前2 h打开冷冻干燥机使冷凝器降至-40℃以下的工作温度，抽真空并使真空度达100 μ Hg以上，然后将安瓶均匀置于冷冻室内搁板上，升华干燥50 h左右；待安瓶里内容物具有一定的物理形态，呈现乳白色疏松海绵状，则改变仪器状态进行解析干燥2 h，除去内容物里的结合水成分；进行封口、压盖、贴签，并于4℃冰箱贮存。

1.3.3 能力验证样品的质量检查

分别取制备好的微生物冻干样品各10瓶，用营养肉汤复水后按照标准方法进行测定；4℃保存1个月后，同法测定，通过测定结果比较进行样品均匀性与稳定性的验证。

1.4 考核项目与要求

1.4.1 菌落总数

无菌开启冻干样品瓶盖，用5 mL稀释液溶解其中的冻干粉末，进行细菌总数的测定，也可参照SN/T 0168-1992《出口食品平板菌落计数》进行计数。

1.4.2 能力验证样品中致病菌的检测

无菌开启冻干样品瓶盖，用5 mL待检菌生长适宜的营养肉汤溶解其中的冻干粉末，并置于36±1℃恒温箱中培养8 h。为更好地分离到目标菌，建议在选择性平板上进行划线分离。其它步骤也可以参考现行国家或行业标准进行操作。

1.4.3 报告要求

所有参加考核的实验室需在领取样品一周后报告试验结果，同时要提交详细的检验原始记录，并加盖企业公章。若实验室采用非标准方法，需对检验方法进行描述。

1.5 考核结果评价方法

参考GB/T 15483.1-1999标准，用国际上通用的稳健统计技术，即Z比分数进行评价和分析菌落总数[3-4]。当稳健Z比分数≤2为满意值；2＜Z值＜3为尚可接受，为复查值；Z值≥3者为不满意结果，为离群值。副溶血弧菌与拟态弧菌混合样、金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌混合样、部分干扰盲样（不含待检目标菌）为随机发放，检测过程中要结合细菌菌落形态、生化反应进行判断，报告为检出或未检出。

2 结果

2.1 能力验证样品的制备结果

按照上述冷冻干燥工艺制备微生物能力验证样品后，每批取10个样品依行业标准方法进行质量检查。菌落计数结果经单因素方差分析[1]，方差比（F）值分别为1.82和1.67，小于F0.05的临界值5.19，表明菌落计数样品间金黄色葡萄球菌含量无显著差异，其均匀性完全满足水平测试的要求。能力验证样品中副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌的检测结果均符合预期，生化试验与真空冷冻干燥前期一致，且拟态弧菌和表皮葡萄球菌的含量也符合预设要求。另外，样品于4℃条件下贮存1个月后重复检测以上项目，菌落计数和致病菌检测结果比对发现，细菌总数无明显变化，细菌生化特性亦未改变，表明冷冻干燥样品在4℃贮存时其稳定性符合要求。

2.2 菌落总数计数的考核结果

对舟山市88家水产品企业的两批菌落总数计数结果进行统计学处理，分别计算出其中位数和稳健Z比分数，其中稳健Z比分数≤2的水产品企业72家，总体满意率为81.8%；结果尚可接受数为6，占总企业数的6.8%；结果不满意者为9家，占10.1%。水产品企业实验室菌落总数考核结果统计分析见表1。

表1 舟山巿水产品企业菌落总数能力验证结果分析Tab.1 The results of colony counting proficiency testing of aquatic enterprises in Zhoushan

2.3 病原菌检测的考核结果

根据不同水产品出口地的菌种限量要求，参加金黄色葡萄球菌检测项目的水产品企业（主要出口欧盟、美国、加拿大等）56个，参加副溶血弧菌检测项目的水产品企业（主要出口日本、韩国等）32个。在干扰样品和混合样品中，副溶血弧菌检测的正确率较为理想，高达93.8%；而金黄色葡萄球菌检测的满意率较低，仅为82.1%，主要是由于表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌两种细菌在Baird-Park琼脂上的菌落形态相似，或者检验人员对金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶试验结果判断失误。

表2 舟山巿水产品企业病原菌检测能力验证结果分析Tab.2 The results of pathogenic bacterial proficiency testing of aquatic enterprises in Zhoushan

2.4 水平测试结果的综合评价

在参加能力验证的88家水产品企业中，菌落总数与致病菌检测的结果均不合格的企业3家。菌落总数计数是水产品中微生物检验的必检项目，但仍有9家企业计数结果存在较大偏差。通过检测报告分析，其原因有：样品梯度稀释不均匀；数据单位换算错误：实验前未对所用容器、试剂进行无菌核查而引入了外源性微生物。致病菌检测共有11家未达到检测要求，其原因有：干扰菌的设置提高了检测的难度；检测人员对同属细菌的鉴别经验不足；对副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的某些生化现象判断不准等。另外，试验过程中未进行空白对照实验，未采用标准菌株进行确证试验的不规范操作也很常见。

3 讨论与分析

在冷冻干燥技术保存微生物研究的基础上，我们探索并建立了冷冻干燥技术制备的微生物能力验证样品的工艺。针对副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的最佳生长条件优化了不同浓度与共溶点的冷冻保存液A和冷冻保存液B，并筛选适合能力验证样品的合适的细菌浓度，研究了样品在真空条件下升华干燥的时间，即50 h左右即可减少内容物里90%以上的水分，而时间过短或过长都会改变或影响内容物的物理状态。结果显示，本研究以金黄色葡萄球菌为目标菌所制备的菌落计数样品均匀性和稳定性良好，用于致病菌检测的样品也符合质控盲样的要求。另外，本研究对于冷冻干燥技术的探索，对于其它种类微生物能力验证样品的制备也提供了一定的技术参考。

能力验证考核的是实验室硬件与软件的综合实力。在硬件条件达标的情况下，只有不断提高检验人员的检测技术水平，才能实现对水产品原料或样品中微生物的早发现早处理，并防止有安全隐患的水产品流入正常销售渠道。综合以上因素，舟山市水产品企业实验室微生物的检测能力正在不断提高，但仍需从以下几方面继续加强实验室检验质量控制工作：需要建立健全实验室内部质量管理体系，制订合理全面的检验规章制度；实验室检验人员要加强业务素质培训，定期参加实验室检测能力验证；仪器设备、试剂使用前必须经过仪器状态和试剂质量核查；试验室与无菌操作环境也要定期监控与记录[5]。

[1]卢行安,郑 江,曹志军,等.微生物能力验证样品均匀性试验的研究[J].中国微生态学杂志,2003,15(1):33-34.

[2]董充慧,苏 杭,张特立,等.真空冷冻干燥技术在生物制药方面的应用[J].沈阳药科大学学报,2009,26(7):76-78.

[3]GB/T 15483.1利用实验室间比对的能力验证：能力验证计划的建立和运作[M].北京：中国标准出版社,2004.

[4]HORWITZ W,BRITTON P,CHIRTEL S J.A simple method for evaluating data from an inter laboratory study[J].J AOAC Int,1998,81(6):1 257-1 265.

[5]张秀丽,廖兴广,张 蒙,等.2003年河南省食品卫生微生物检验质量控制考核结果的评价与分析[J].中国卫生检验杂志,2005,15(7):856-857.