阪崎肠杆菌及与肠杆菌科其他细菌差异比较

高建新，傅松哲，龙慧,肖菊珍

（南昌市疾病预防控制中心，南昌330038）

阪崎肠杆菌及与肠杆菌科其他细菌差异比较

高建新，傅松哲，龙慧,肖菊珍

（南昌市疾病预防控制中心，南昌330038）

为进一步推动乳品企业对每批次婴幼儿配方乳粉进行阪崎肠杆菌出厂检验，寻求准确，更加便捷、且检测费用低廉的检测方法。选择3种基础肠道分离培养基组合应用进行了研究，分离阪崎肠杆菌并对几种常见的肠杆菌科细菌在5种肠道分离培养基上生物学特性反应差异比较，以及对3种方法所用的培养基分离鉴定结果进行比较。结果表明,3种基础肠道分离培养基组合应用，观察其不同形态特征及生物学特性反应后，可初步判别阪崎肠杆菌及肠杆菌科中不同的属以及同属不同种。3种用于分离鉴定阪崎肠杆菌方法，无统计学差异。该方法分离崎肠杆菌准确、操作便捷、且检测费用低廉，有利于乳品企业对每批次产品进行阪崎肠杆菌监控。

阪崎肠杆菌；肠杆菌科细菌；生物学特性差异比较

0 引言

在婴幼儿配方乳粉中，肠杆菌科其他病原体也常有检出，1988年Muytjens等报告说，来自35个国家的婴幼儿配方乳粉中受的肠杆菌科细菌污染的占52.5%[2]。其中阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌的分离频率最高[3]。

2003年，由Druggan-Forsythe-艾弗森发明了DFI显色培养基[4]，该培养基利用5-溴-4-氯-3吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷，使阪崎肠杆菌在该培养基上呈现出蓝绿色反应。2007年艾弗森和Forsythe发现由于α-葡萄糖苷酶基因的变异，阪崎肠杆菌菌株也可以不表达α-葡萄糖苷酶活性[5]。

由于显色培养基的局限性，本研究选择伊红美蓝、麦康凯、山梨醇麦康凯3种基础肠道分离培养基组合应用进行了研究，分离阪崎肠杆菌以及对几种常见肠杆菌科细菌在5种分离培养基上生长情况及生物学特性反应差异进行了比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

阪崎肠杆菌标准株ATCC295444，ATCC29004，CMCC45401，大肠埃希菌ATCC25922，阴沟肠杆菌CMCC45501，肺炎克雷伯氏菌CMCC46114，柠檬酸杆菌CMCC48021，变形杆菌CMCC49027，沙门氏菌ATCC50662，志贺氏菌CMCC51573。阪崎肠杆菌（6株），聚团肠杆菌NCCDC0919-21，非脱羧埃希氏菌NCCDC09190211菌株由本中心分离。

1.1.2 培养基

伊红美蓝（EMB），麦康凯（MacConKey），山梨醇麦康凯（SorbitolMacConKey），微量生化管，结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA），显色培养基（Xa-GicA、DFI）。

1.2 方法

1.2.1 样品检测分离鉴定

（1）样品修复培养（前增菌）。无菌称取100 g乳粉加入500 mL预热45℃BP中，混匀，经36℃±1℃培养18-24 h。

（2）样品肠道增菌培养。移取10 mL加入90 mL EE肉汤中，于36℃±1℃培养18～24 h。

（3）样品分离培养。取EE增菌肉汤培养物1环，分别划线接种EMB，MacConKey，Sorbitol-MacConKey琼脂平板各1块，置36℃±1℃培养18～24 h。观察3种平板上的菌落形态及不同的生物学特性反应。

（4）生化鉴定。挑取单个可疑菌落分纯或接种TSA钭面，生化鉴定至种。

1.2.2 生物学特性反应差异比较

取本中心分离鉴定菌株及几种常见肠杆菌科标准菌株纯培养物，分段划线于5种肠道分离培养基，对其形态及生物学特性反应差异比较。

1.2.33 种方法分离鉴定比较

应用行标、国标及本研究方法，对市场婴幼儿配方乳粉抽检，分离鉴定乳粉中阪崎肠杆菌，并对结果进行比较，统计学分折。

1.2.4 统计学处理

实验数据统计处理采用SPSS11.5软件进行。

2 结果

2.1 3种基础肠道分离培养基上生物学特性

（1）阪崎肠杆菌在EMB琼脂平板上呈紫红色黏液状，菌落较大，相邻菌落之间易于融合。在MacConKey琼脂平板上大小1.8～2.5 mm，呈淡粉色。在Sorbitol-MacConKey琼脂平板上不发酵山梨醇，形成中等大小、圆形突起、边缘整齐的淡黄色菌落。

（2）阪崎肠杆菌形态与染色。革兰氏染色镜检为G一无芽孢短小杆菌，呈球杆状或成对排列,有时亦可呈短链状。

（3）阪崎肠杆菌生化特性。菌株触酶阳性、氧化酶阴性、动力阳性、葡萄糖代谢类型(0/F)为发酵型(F)，IMViC：靛基质-MR-VP+柠檬酸盐+，在TSA钭面上产黄色色素。做进一步生化鉴定，结果如表1所示。

表1 菌株进一步生化鉴定结果

2.2 在5种分离培养基上生物学特性比较

阪崎肠杆菌与几种常见的肠杆菌科细菌在5种分离培养基上形态与的生物学特性比较表明；阪崎肠杆菌在EMB琼脂平板上呈紫红色黏液状，在MacConKey琼脂平板上呈淡粉色，在SorbitolMacConKey琼脂平板上不发酵山梨醇，中等大小、圆形突起的淡黄色菌落。聚团肠杆菌与阪崎肠杆菌同属于肠杆菌属，在Mac-ConKey和SorbitolMacConKey平板上菌落形态与生物学特点与阪崎肠杆菌很相似，也同样可产生黄色色素，但在EMB平板上有明显差异，菌落呈紫红色，边缘整齐圆形突起，菌落约1.8～2.3 mm。阴沟肠杆菌在SorbitolMacConKey平板上呈发酵山梨醇红色菌落，肺炎克雷伯氏菌在EMB平板上有黏液，在MacConKey和SorbitolMacConKey琼脂平板上呈粉红色、红色菌落，大多数中间有黄色色素。大肠埃希菌在EMB平板上呈紫绿色,有金属光泽,有黑心，沙门氏菌在EMB、Mac-ConKey均为无色，但在SorbitolMacConKey平板上呈红色。志贺氏菌在这3种基础分离培养基上为无色、细小，约1.0 mm。变形杆菌在EMB、MacConKey有迁延生长现象。Xa-GiaA、DFII二者为显色培养基，阪崎肠杆菌在此培养基上呈蓝绿色反应。但非脱羧埃希氏菌也有蓝绿色反应。如表2所示。

2.3 3种方法所用分离培养基结果比较

2008年对市场抽检的39件婴幼儿配方乳粉应用3种基础肠道分离培养基与SN/T1632.1-2005行标所用Xa-GicA培养基，同时检出阳性2件，阳性率5.13%。2009年对市场抽检的23的件婴幼儿配方乳粉，检出阳性2件,阳性率8.70%。2010年1月～9月，对市场抽检的27的件婴幼儿配方乳粉，检出阳性2件,阳性率7.40%。3种基础肠道分离培养基组合应用与国标推荐所用DFI培养基及行标推荐所用Xa-GicA培养基，3种方法所用培养基检测无统计学差异。见表3。

表2 几种常见肠杆菌科细菌在5种分离培养基上生物学特性反应差异比较结果

表3 3种方法检测阪崎肠杆菌结果比较

4 讨论

（1）从婴幼儿配方乳粉中分离肠道致病菌，第1个步骤对样品进行修复培养。乳粉在生产加工过程中，致病菌易受到亚致死性损伤，缓冲蛋白胨水（BP）是由胨、肽氨基酸组成的缓冲体系，易于进入菌体细胞内，有促进细菌修复生长的作用[6]。

（2）第2个步骤是肠道增菌培养，增菌培养基灵敏度高，分离培养目标菌的机率就大。我们在实验室应用3种阪崎肠杆菌标准株，对两种肠道增菌培养基(mLST-Vm、EE）进行增菌效果比较，经10倍稀后，阪崎肠杆菌1个cfu的条件下，两种增菌培养基增菌效果无差异。选择EE肠道增菌肉汤培养便捷，灭菌后2～8℃冰箱保存，4周之内可以使用[7]。

（3）在分离培养基选择上应选用弱选择性和强选择性培养基各1种或鉴别培养基进行分离培养，增加分离平板的种类。我们选择3种基础肠道分离培养基组合应用，凡肠杆菌科的细菌都能在此平板上生长，并能观察其不同菌落形态特征及生物学特性反应，可初步判别肠杆菌科中不同的属以及同属不同种。EMB为弱选择性培养基，阪崎肠杆菌在EMB琼脂平板上呈紫红色不规则粘液状，此平板作为辅助观察，不宜在此平板上挑取单个菌落。MacConKey为选择性分离培养基，阪崎肠杆菌在MacConKey琼脂平板上呈边缘整齐1.8～2.5 mm，淡粉色菌落，应用MacConKey平板可观察肠杆菌科细菌乳糖发酵情况。SorbitolMacConKey可以作为鉴别培养基，阪崎肠杆菌有不分解山梨醇的特性，挑取菌落应选择在SorbitolMacConKey上淡黄色或无色菌落。经应用结果表明；3种基础肠道分离培养基组合应用，可选择性分离到肠杆菌科的种，可初步判别肠杆菌科中不同的属以及同属不同种，再进一步进行生化鉴定。

（4）Xa-GiaA、DFI培养基，二者为显色培养基。利用阪崎肠杆菌具有a-D-葡萄糖苷酶，在培养基中添加5-4氯-3-吲哚-a-D-吡喃葡萄糖苷，阪崎肠杆菌在此显色培养基上呈蓝绿色反应，优点是菌落区分直观，但也并不是唯一性的阪崎肠杆菌所具有的生物学特征。罗茂凰报道：痢疾志贺菌、非脱羧埃希氏菌，荧光假单胞希菌在Xa-GiaA平板上能产生蓝绿色反应，陆峥也报道福氏志贺菌也同样可产生蓝绿色反应。

（5）3年来使用3种基础肠道分离培养基组合应用分离阪崎肠杆菌，准确、便捷，且检测费用低廉。按每个平板17 mL量计算，行标所用Xa-GiaA培养基平板价格35.42/个，国标所用DFI培养基平板价格20.32/个，我们选择3种基础肠道分离培养基组合应用，3块平板价格共0.82元，更有利于乳品企业对每批次产品进行阪崎肠杆菌监控。

[1] IVERSEN C.FORSYTHE S J.Risk profile of Enterobacter sakazakii,an emergent pathogen associated with infant milk formula[J].Trends of Food Science and Technology,2003,14:443–454.

[2] MUYTJENS H L,ROELOFS-WILLEMSE H，JASPAR G H.Quality of powdered substitutes for breast milk with regard to members of the family Enterobacteriaceae.[J]J.Clin.Microbiol.1988,26,743–746.

[3] ESTUNINGSIH S,KRESS C,Hassan A A,et al.Enterobacteriaceae in dehydrated powdered infant formula manufactured in Indonesia and Malaysia[J].J.Food Prot,2006,69,3013-3017

[4] DRUGGAN P,FORSYTHE S J,IVERSEN C.The Druggan-Forsythe-Iversen agar(DFI),a chromogenic medium for the detection fo Enterobacter sakazakii.104th ASM General Meeting,New Orleans,LA.2004.

[5] IVERSEN C,FORSYTHE S J.Comparison of media for the isolation of Enterobacter sakazakii[J],Appl Environ Microbiol,2007,73(1):48-52.

[6] 高建新.卢兆芸.肖菊珍.奶粉中阪崎肠杆菌检测方法[J].中国乳品工业，2009，37（5）：40-43.

[7] 高建新.陈海婴.卢兆芸.奶粉中一株阪崎肠杆菌的分离鉴定[J].现代预防医学，2010，37（1）：105-106.

[8] 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准.SN/T1632.1-2005奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第1部分：分离与计数方法[S].北京：中国标准出版社，2005.

[9] 中华人民共和国卫生部食品安全国家标准.GB4789.40-2010食品微生物检验阪崎肠杆菌检验[S].北京：中国标准出版社，2010.

Application of three cost-effective medium for the detection of Enterobacteriaceae

GAO Jian-xin,FU Song-zhe,LONG Hui,XIAO Ju-zhen
(Nanchang Center for disease control and prevention,Nanchang,330038)

Objective:To further promote the monitoring of Enterobacter sakazakii for each batch of infant formula,accurate,convenient,and low-cost detection method was developed.Methods:three kinds of culture media were combined to isolate E.sakazakii.Enterobacteriaceae and several common intestinal bacteria were cultured in 5 kinds of mediums,their biological characteristics were compared,the three methods(line standard,national standard,this method)were also compared with results of isolation and identification media.Results:Through the combination of eosin-methylene-blue,MacConkey and sorbitol-MacConkey media，the morphological and biological characteristics of different media was also observed.Based on these isolation mediums,Enterobacteriaceae can be distinguished into different genera and different species.Three methods used for isolation and identification of E.sakazakii without significant difference(value U=0.1009，P=0.908＞0.05).The methods is accurate and low-cost,easily-operated,beneficial to monitoring E.sakazakii of every batch of dairy products.

Enterobacter sakazakii;Enterobacteriaceae;different biological characteristics

Q93-331，Q93-335

A

1001-2230（2011）02-0024-03

2010-09-25

高建新（1954-），女，副主任技师，从事乳制品及食品微生物检测工作。