乳清蛋白-木糖美拉德反应产物的成膜性及其膜包裹对核桃仁脂质过氧化的抑制作用

张 曦，李 琦，景 浩*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

乳清蛋白-木糖美拉德反应产物的成膜性及其膜包裹对核桃仁脂质过氧化的抑制作用

张 曦，李 琦，景 浩*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

乳清蛋白是常用的成膜材料，乳清蛋白膜对氧气等气体有良好的阻隔能力，但其机械强度和水蒸气透过率较差。本实验研究木糖质量浓度和甘油体积分数对乳清蛋白的膜物理和机械特性以及水蒸气透过率的影响，优化成膜最佳条件，并对乳清蛋白和乳清蛋白-木糖美拉德反应产物的成膜特性进行比较。观察用乳清蛋白膜和乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜分别包裹核桃仁后对核桃仁脂质过氧化的影响。结果表明，乳清蛋白-木糖美拉德反应产物的成膜最佳条件为： 乳清蛋白质量浓度10g/100 mL，木糖质量浓度5g/100 mL，甘油体积分数5%，在80℃加热45min或90℃加热30min。乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜的刺穿强度比乳清蛋白膜提高约1倍，拉伸强度提高约1.5倍，水蒸气透过率降低约24%。乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜包裹可以延缓核桃仁酸价的上升，而乳清蛋白膜对核桃仁的酸价上升无明显的抑制作用。

乳清蛋白；木糖；美拉德反应产物；可食用膜；核桃仁

以乳清蛋白为原料可以形成透明、柔软、有弹性的膜，在较低的湿度下对氧气等气体均有较好的阻隔能力[1]。由于乳清蛋白中含有较高比例的亲水基团，与玉米醇溶蛋白膜相比，单一乳清蛋白膜的机械强度较低，水蒸气阻隔性能较差[2]。木糖可以减少凝胶过程中乳清蛋白分子之间的S—S键和非共价键[3]，而S—S键与乳清蛋白膜的结构有密切关系[1]。作为五碳糖，木糖还可以在短时间内与蛋白质发生美拉德反应，改变乳清蛋白的交联情况，从而可能改变乳清蛋白膜的机械性能和阻隔性能。

核桃仁中油脂含量约占干质量65%[4]，其中约73%为多不饱和脂肪酸[5]，容易发生氧化酸败，产生不良气味，严重影响食品的可接受性[4,6]。已有报道通过可食用膜包裹来延缓核桃仁的酸败。王若兰等[7]的研究表明，喷涂面筋蛋白膜可以显著抑制核桃仁酸价的上升。而玉米醇溶蛋白包膜的核桃仁与对照组相比，过氧化值低14.50%，皂化值降低3.77%，酸价降低30.66%[8]。Mate等[9]指出，经乙酰化单甘酯膜包裹的核桃仁中脂肪酸败的产物显著少于未包膜的核桃仁，而乳清蛋白包膜对核桃仁酸败的保护作用不显著。通过进一步改善乳清蛋白的成膜特性，可能有助于加强包膜对核桃仁的保护作用。本实验研究木糖质量浓度、甘油体积分数对乳清蛋白-木糖美拉德反应产物(maillard reaction products，MRPs)膜物理和机械特性、水蒸气阻隔性的影响，确定成膜条件，并用所得膜包裹核桃仁，观察包膜对核桃仁酸价的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

核桃(Juglans regia)产自新疆，实验前去壳，将核桃仁取出备用。

乳清分离蛋白(Whey protein isolate，WPI；其中含蛋白质95%以上，含脂肪1.0%以下，含灰分3.0%以下，含乳糖1.0%以下) 美国Davisco Foods International公司；甘油(分析纯) 北京京顺化学试剂有限公司；木糖(Xylose；含量98.5%) 北京嘉康源科技发展有限公司。

UV-2102 PC型紫外-可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；TMS-PRO 食品物性测定仪 美国Food Technology公司；数显千分卡尺 成都成量有限公司；DHG-9245A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 膜的制备方法

分别配制乳清蛋白质量浓度为20g/100mL，木糖质量浓度为20g/100mL、甘油体积分数50%的储备液。按实验设计比例和浓度将乳清蛋白储备液和木糖储备液进行混合，并补加甘油和水。其中，蛋白质量浓度为10g/100mL，木糖质量浓度范围2.5～7.5g/100mL，甘油体积分数范围4%～6%。将溶液在80℃水浴加热45min或90℃加热30min，冷却至室温(20℃)后倒入平皿，室温(20℃)条件下成膜。

1.3 膜物理特性测定

取边缘完整的膜，在距离膜边缘1cm处均匀取8个点，用数显千分卡尺测定其厚度，记录显示的厚度数值并取平均值[10]。

将成膜溶液倒入平皿后称量溶液与平皿的总质量，成膜后测定膜与平皿的总质量。成膜期间的失水量由公式(1)计算。

每组设4个重复，计算平均值。

取透明无印迹的膜，剪成长约4cm，宽约1cm的长条，取两个长条贴在比色皿内壁，测定其在波长550nm处吸光度，测定重复3次[11]。

进行SDS-PAGE分析时，在凝胶玻璃版中先后加入约5.5mL分离胶(15%，pH8.8)和1.5mL浓缩胶(5%，pH6.8)。将样品稀释至蛋白质质量浓度为1mg/mL，与等体积样品处理液混合后煮沸5min。每孔加样17.5μL。样品经过浓缩胶时，电压为80V，经过分离胶时，电压为120V，经2.5h后溴酚蓝指示剂到达底端，电泳结束。经考马斯亮兰-R250染色后，由含有甲醇、乙酸的脱色液脱色至条带清晰可见[12]。

1.4 膜机械特性测定

测定刺穿强度时，将剪成半圆形的膜固定于有机玻璃夹板间，使其位于物性测定仪测试探头下方。测试时直径为2mm的针形探头以60mm/min的速度下降并刺穿膜。记录刺穿强度及刺穿变形，重复3次取平均值[13-14]。测定拉伸强度时，将膜剪成长约6cm，宽约2cm的长条，固定于物性测定仪的金属夹片中。测试时金属夹片带动膜的上端以60mm/min的速度上升，使膜断裂。记录拉伸强度及伸长率，重复3次取平均值。伸长率(E)由公式(2)计算[14]。

式中：ΔL为膜断裂时被拉伸的长度；L0为膜的原始长度。

1.5 水蒸气透过率的测定

水蒸气透过率(water vapor permeability，WVP)的测定参考Turhan等[15]。将膜密封于装有5g无水氯化钙(相对湿度为0)的装置封口处，置于装有饱和KBr溶液(相对湿度为80%)[16]的密封干燥器内。在室温条件下测定每个有机玻璃装置在4h内每隔40min的质量增加量，记录7次测定的结果，用来表示经过膜进入测定装置的水蒸气质量。

水蒸气透过率(WVP)计算公式为：

式中：Δm为一定时间内WVP测定装置的质量增加量/g；d为膜厚度/mm；A为膜有效测定面积/m2；t为测定时间间隔/h；ΔP为膜两侧的水蒸气压差/kPa。本实验中，膜有效测定面积A值为0.00785m2，ΔP值为1.9377kPa。

1.6 核桃仁包膜和脂质过氧化的测定

1.6.1 核桃仁的包膜和强制氧化

根据前期实验结果，选择最佳条件下的乳清蛋白成膜溶液和乳清蛋白-木糖美拉德反应产物成膜溶液，将200mL成膜溶液加热并冷却至20℃(室温)，选择直径约为2.5cm的核桃小心剥壳取出核桃，每组称取150g核桃仁，将从一个核桃中取出的仁分成四分之一大小，即为实验所用核桃仁。核桃仁浸入成膜溶液后，用玻璃棒轻轻搅拌2min，保证所有核桃仁被成膜溶液均匀包裹。将浸泡后的核桃仁置于铁笊篱上沥干溶液，铺于硫酸纸上，在自然条件下晾干(约12h)。

实验前一天将盛有饱和KBr(相度80%)的干燥器放入温度为50℃的烘箱中。平衡后将经包膜处理的核桃仁置于其中，每5d取出30g核桃仁，在研钵中磨碎。将粉末在150mL石油醚中浸泡12h后，2800×g离心10min。将上清液在40℃条件下真空旋转蒸发，得到核桃仁油脂备用。

1.6.2 核桃仁酸价的测定

根据GB/T 5530—2005《动植物油脂酸价和酸度测定》[17]所提供的方法测定酸价。在50mL乙醇和乙醚(体积比为1:1)中加入3g油脂。以酚酞为指剂，用0.1mol/L KOH滴定至溶液呈浅粉色，记录所消耗体积。根据公式(4)计算酸价。

式中：cKOH为KOH的浓度/(mol/L)；VKOH为滴定所用KOH体积/mL；moil为油脂质量/g。

1.7 数据分析

数据的显著性差异由Minitab软件(Minitab Inc.，PA，USA)进行分析。对数据进行单因素方差分析(one way analysis of variance，one way ANOVA)，以Tukey多重比较进行检验，得到各组数据间的显著性差异(P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度木糖与乳清蛋白的美拉德反应

反应体系含乳清分离蛋白5g/100mL 或10g/100mL，木糖5g/100mL，在80℃或90℃加热，每隔15min取样一次；对吸光度进行显著性分析。

如表1所示。由于乳清蛋白溶液成膜前常用的加热温度为80℃和90℃，因此实验选择了以上两种温度研究乳清蛋白和木糖的美拉德反应。加热使体系在波长450nm处的吸光度逐渐上升，其中加热温度较高以及乳清蛋白浓度较高时，吸光度的变化更加明显。在80℃加热45min或90℃加热30min时，溶液的吸光度有较明显的变化，同时目测发现溶液有不同程度地变黄，证明乳清蛋白与木糖发生了不同程度的美拉德反应。

图1 不同质量浓度乳清蛋白与木糖加热产物的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of WPI/xylose MRPs under different conditions of system composition and reaction parameters

如图1所示，加热前，电泳结果呈现典型的乳清蛋白特征，其中位于图像下端的条带为α-乳白蛋白，上端条带为为β-乳球蛋白[18]。经80℃加热45min或90℃加热30min后，SDS-PAGE显示有明显的拖带，即高分子产物生成，在31～45kD之间也有新的条带出现，证明在此加热条件下，乳清蛋白与木糖的反应体系中大分子物质的含量增加，美拉德反应已进展以较明显程度。选择该条件制备成膜溶液，优化成膜条件。

2.2 不同质量浓度木糖对成膜特性的影响

反应体系含乳清分离蛋白10g/100mL，木糖2.5、5、7.5g/100mL，甘油体积分数5%，在80℃加热45min或90℃加热30min；溶液冷却至室温(20℃)后倒入成膜皿，测定膜特性，结果见表2、3。

表1 不同质量浓度乳清蛋白和木糖在加热时吸光度的变化(n=3)Table 1 Absorbance change in WPI/xylose systems in different mixing proportions during heating (n = 3)

表2 不同质量浓度木糖对乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜物理特性的影响(n=3)Table 2 Effect of xylose concentration on physical properties of WPI/xylose MRPs film (n = 3)

表3 不同质量浓度木糖对乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜机械特性的影响(n=3)Table 3 Effect of xylose concentration on mechanical properties of WPI/xylose MRPs films (n = 3)

表4 不同体积分数甘油对乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜物理特性的影响(n=3)Table 4 Effect of glycerol concentration on physical properties of WPI/xylose MRPs film (n = 3)

表5 不同体积分数甘油对乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜机械特性的影响(n=3)Table 5 Effect of glycerol concentration on mechanical properties of WPI/xylose MRPs film (n = 3)

80℃和90℃加热时不同木糖质量浓度对乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜的物理和机械特性的影响分别如表2、3所示。木糖质量浓度在2.5～7.5g/100mL之间时，膜可完整揭下，测定物理和机械性能。膜的厚度随木糖质量浓度的增加而增加，成膜时失水量显著减少。刺穿强度和拉伸强度可以在一定程度反映膜机械强度的大小，其值随着木糖质量浓度的增加逐渐降低。膜的刺穿变形和伸长率与膜的柔韧性和弹性有关，木糖质量浓度对其无显著影响。据报道，在壳聚糖膜中添加少量木糖时膜的拉伸强度增大，随着木糖质量浓度的增加，膜的拉伸强度则减小[19]。木糖分子中含有的－OH使分子间空隙增大[20]，膜的机械强度减小。

2.3 不同体积分数甘油对成膜特性的影响

确定木糖质量浓度后，还需要调整甘油质体积分数，以优化乳清蛋白-木糖-甘油膜的性质。反应体系含乳清分离蛋白10g/100mL，木糖5g/100mL，甘油体积分数4%、5%、6%，在80℃加热45min或90℃加热30min；溶液冷却至室温(20℃)后倒入成膜皿，测定膜特性。进行成膜条件的选择。

80、90℃加热后不同体积分数甘油对乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜物理和机械特性的影响分别如表4、5所示。甘油体积分数在4%～6%之间时，成膜可完整揭下，测定其物理和机械特性。膜厚度随着甘油体积分数的增加而增加，成膜期间的失水量则逐渐下降。随着甘油体积分数的增加，膜的刺穿强度和拉伸强度逐渐下降，而刺穿强度和伸长率基本未受甘油体积分数的影响。在成膜时，甘油中的－OH可以与蛋白发生反应，增加成膜柔韧性，但膜的机械强度也随之降低[21]。

2.4 木糖质量浓度和甘油体积分数对膜水蒸气透过率的影响

图2 不同质量浓度木糖对乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜水蒸气透过率的影响Fig.2 Effect of xylose concentration on WVP of WPI/xylose MRPs film

随着木糖质量浓度的增加，乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜的水蒸气透过率均呈逐渐上升的趋势(图2)。据报道，乳清蛋白膜与普鲁兰糖共同成膜时，水蒸气透过率随着木糖质量浓度的增加而增加[22]，而蜂蜡[23]和树胶[20]对乳清蛋白膜的水蒸气透过率无明显影响。木糖中含有一定数量的－OH，使成膜的亲水性增加，从而降低其对水蒸气的阻隔能力。

选择成膜质量浓度时，在膜厚度方面，2.5g/100mL与5g/100mL的木糖质量浓度均较合适，而7.5g/100mL的木糖质量浓度成膜稍厚。含有3种质量浓度木糖的美拉德反应产物膜均呈献透明的黄色。体系中含有2.5g/100mL木糖时，膜机械强度大、稍硬，含有7.5g/100mL的木糖时，膜机械强度小、稍软，且黏平皿，而含有5g/100mL木糖的膜机械强度适中，同时保持了一定的水蒸气阻隔能力，是较合适的成膜质量浓度。

图3 不同体积分数甘油对乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜水蒸气透过率的影响Fig.3 Effect of glycerol concentration on WVP of WPI/xylose MRPs film

随着甘油体积分数的增加，膜的水蒸气透过率均呈逐渐上升的趋势(图3)。该结果与溶液孔径随甘油体积分数的增加而增加有关，也与成膜的厚度有一定关系[22]。

体系中含有3种体积分数的甘油时，膜的厚度均在可接受范围，颜色和吸光度也无明显差异。甘油体积分数为4%时，膜机械强度较大、稍硬；甘油体积分数为6%时，膜机械强度变小；而甘油体积分数为5%时，膜机械强度适中，同时保持了一定的水蒸气阻隔能力，较适合成膜。

2.5 乳清蛋白和乳清蛋白-木糖美拉德反应产物成膜特性的比较

在早期实验中，根据膜的物理和机械特性以及水蒸气透过率，确定了乳清蛋白的成膜最佳条件：乳清蛋白10g/100mL，甘油10%，80℃加热30min。而本实验中，乳清蛋白-木糖美拉德反应产物的成膜最佳条件为，乳清蛋白10g/100mL、木糖5g/100mL、甘油5%，80℃加热45min或90℃加热30min。将最佳条件下制备的乳清蛋白膜和乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜进行比较，分析其物理和机械特性，以及水蒸气透过率的差异。

表6 乳清蛋白和乳清蛋白-木糖美拉德反应产物的膜物理特性(n=3)Table 6 Physical properties of WPI film and WPI/xylose MRPs film(n = 3)

表7 乳清蛋白和乳清蛋白-木糖美拉德反应产物的膜机械特性(n=3)Table 7 Mechanical properties of WPI film and WPI/xylose MRPs film (n=3)

作为最佳成膜体系，乳清蛋白膜、乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜物理和机械特性如分别如表6、7所示。乳清蛋白膜厚度较小，膜透明无色，吸光度小，乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜较厚，膜为透明的黄色，吸光度稍大。在机械强度方面，乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜机械强度较大，同时维持了一定的柔韧性和弹性。

图4 乳清蛋白和乳清蛋白-木糖美拉德反应产物的膜水蒸气透过率Fig.4 WVP of WPI film and WPI/xylose MRPs film

表8 乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜包裹对核桃仁酸价的影响Table 8 Change in acid value of walnut coated with WPI film or WPI/xylose MRPs film with the prolongation of storage time

作为最佳成膜体系，乳清蛋白膜-木糖美拉德反应产物膜的水蒸气透过率小于乳清蛋白膜(图4)，具有更加有效地延缓核桃仁酸败的潜力。

在安全性方面，作为原料的乳清蛋白是常用的可食物膜材料[24]，根据乳清蛋白协会的信息，对牛奶蛋白无过敏症状的人，还没有乳清蛋白副作用的报道[25]。此外，也有报道将木糖与壳聚糖共同成膜[19]，而F344大鼠实验也表明木糖不具有致癌性[26]。具体到乳清蛋白-木糖美拉德反应产物的食用安全性，笔者曾用Hela细胞和HepG2细胞进行了验证。研究表明，在给定的浓度范围内，乳清蛋白以及乳清蛋白-木糖美拉德反应产物成膜溶液没有造成细胞死亡，对该细胞无毒。

2.6 乳清蛋白-木糖美拉德反应产物包膜对核桃仁酸价的影响

加热期间核桃仁酸价的变化如表8所示。0d时，核桃仁的酸价在0.5～0.65之间。在50℃、相对湿度80%的环境中进行储藏，核桃仁的酸价均有不同程度的上升，在该储藏条件下，第15天和第20天，未包膜的核桃仁和包有乳清蛋白膜的核桃仁酸价上升的速度大于美拉德反应产物包膜的核桃仁。

食品中的游离脂肪酸极容易氧化，产生不愉快的气味和风味，酸价可以表示游离脂肪酸的含量，经常被用作评价食品品质的指标[6]。实验发现乳清蛋白膜包裹对核桃仁酸败没有明显的延缓作用，与Mate等[9]的结果类似，他们认为该结果与核桃仁表面的皱缩有关。经美拉德反应产物包裹的核桃仁，其酸价上升的速度与其他组核桃仁相比较慢，即核桃仁的酸败变缓。在美拉德反应产物膜中甘油含量低于乳清蛋白膜，因此可以减少核桃仁的皱缩程度，同时可以降低膜水蒸气透过率，因此美拉德反应产物膜对核桃仁的保护作用更加明显。

3 结 论

乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜的厚度随着木糖质量浓度和甘油体积分数的增加而增加。吸光度随着木糖质量浓度的增加而增加。膜的机械强度随着木糖浓质量浓度和甘油体积分数的增加而下降。成膜的水蒸气透过率随着木糖质量浓度和甘油体积分数的增加而增加。综合考虑各因素，乳清蛋白-木糖-甘油的最佳成膜条件为：乳清蛋白10g/100mL、木糖5g/100mL、甘油体积分数5%，在8℃加热45min或90℃加热30min，冷却至20℃左右后，室温成膜。乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜的刺穿强度比乳清蛋白膜提高约1倍，拉伸强度提高约1.5倍，水蒸气透过率降低约24%。乳清蛋白-木糖美拉德反应产物包膜后，核桃仁酸价上升的速度变慢，核桃仁酸败的程度减缓。

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Film-forming Properties of Maillard Reaction Products Formed from Whey Protein and Xylose and Their Inhibitory Effect on Lipid Oxidation in Walnut Kernel

ZHANG Xi，LI Qi，JING Hao*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Whey protein isolate (WPI) is one of commonly used film-forming materials and has been considered as a good barrier to oxygen but a poor one to water vapor. In the present study, film-forming properties of Maillard reaction products (MRPs)formed from WPI and xylose such as physical and mechanical properties and water vapor permeability were investigated at different amounts of xylose and glycerol with the aim of optimizing film-forming conditions and a comparison with those of WPI was carried out. In addition, the effects of coating with WPI or WPI/xylose MRPs on lipid peroxidation in walnut kernel were probed. The results indicated that the optimal film-forming conditions of WPI/xylose MRPs were determined to be heating a reaction system containing 10 g of WPI, 5 g of xylose and 5 mL of glycerol per 100 mL at 80 ℃ for 45 min or at 90 ℃ for 30 min.Compared with WPI film, WPI/xylose MRPs film revealed a two-fold increase in penetration strength, an around 2.5-fold elongation strength and a decrease in water vapor permeability by about 24%. Coating with WPI/xylose MRPs film could delay the increase in acid value of walnut kernel, whereas coating with WPI film had no obvious inhibitory effect.

whey protein isolate；xylose；Maillard reaction products；edible film；walnut

TS201.21

A

1002-6630(2011)05-0058-07

2010-07-04

张曦(1986—)，女，硕士，研究方向为蛋白膜的制备和应用。E-mail：zhangxi1024@gmail.com

*通信作者：景浩(1957—)，男，教授，博士，研究方向为营养与食品安全。E-mail：haojing@cau.edu.cn