20种多孔类真菌乙醇提取物体外抗氧化和抗肿瘤活性的比较研究

陈永强，陈先晖，孙 勇，缪 倩，王 力，蒋继宏*

(徐州师范大学 江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏 徐州 221116)

20种多孔类真菌乙醇提取物体外抗氧化和抗肿瘤活性的比较研究

陈永强，陈先晖，孙 勇，缪 倩，王 力，蒋继宏*

(徐州师范大学 江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏 徐州 221116)

采用清除DPPH自由基的方法和Alamar Blue法比较20种多孔类真菌乙醇提取物抗氧化活性和对3株癌细胞体外增殖的影响，对它们的子实体和菌丝体乙醇提取物进行测定。结果表明：20种多孔菌子实体乙醇提取物清除自由基和抗肿瘤活性大部分都强于菌丝体乙醇提取物，其中有10株多孔类真菌子实体乙醇提取物质量浓度在5mg/mL时，自由基清除率超过70%；质量浓度在500μg/mL时，对人非小肺癌细胞NCI-H460和人肝癌细胞HepG2两株癌细胞抑制率在90%左右，而对耐药细胞株Bel-7402/5-Fu抑制率略低于正常细胞株。

多孔菌；抗氧化；DPPH自由基；抗肿瘤活性

多孔菌目真菌是担子菌中的一大类群，在我国的菌类药物中许多属于这一类真菌，如有名的传统中药猪苓、灵芝、茯苓等[1]。目前我国已知的多孔菌有11300余种，已知的药用多孔菌有60余种，而有关报道的具有抗氧化和抗肿瘤活性的多孔类真菌也较多，如灰树花、灵芝、云芝、桦褐孔菌以及俗称“桑黄”的一大类多孔菌等[2-4]。近年来，一些研究人员以大型真菌为材料，对其提取物的抗氧化和抗肿瘤活性进行了研究，并且从其中一些真菌中分离出了一些具有较好抗氧化、抗肿瘤作用的化合物，这表明真菌是寻找抗氧化物质的理想材料[5-6]。

大量研究发现，活性自由基是危害人体健康的重要因素之一。如果人体内自由基的数量过多，会导致脂质过氧化作用，蛋白质和DNA的损伤等造成组织、细胞的损伤，从而诱发衰老或多种疾病，如癌症、心血管病、免疫系统功能下降和脑功能紊乱等疾病[7]。癌症也是严重威胁人类生命健康的重要疾病之一，寻找更为有效及新的抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物具有重要的意义。近年来从食药用真菌子实体中寻找毒副作用小、作用独特、安全的天然活性物质，成为新药开发的有效途径之一。因此天然抗自由基损伤、抗肿瘤活性物质研究引起了病理、药理和临床工作者的广泛重视[8]。

本研究以20种野生多孔类真菌子实体与菌种为材料，采用清除DPPH自由基的方法和Alamar Blue法对其乙醇提取物进行体外抗氧化和抗肿瘤活性检测，为进一步开发抗氧化、抗肿瘤的多孔类真菌保健品及其药品提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

20种野生多孔类真菌子实体与菌种：1.桦剥管孔菌(Piptoporus betulinus)；2.绒毛栓菌(Trametes pubescens)；3.芳香皱皮孔菌(Ischnoderma benzoinum)；4.白皮壳灵芝(Ganodema leucophacum)；5.白迷孔菌(Daedalea albida)；6.钹孔菌(Coltricia perennis)；7.岛生异担子菌(Heterobasidion insulare)；8.毛栓菌(Trametes hirsuta)；9.榆生拟层孔菌(Fomitopsis ulmaria)；10.肉色拟迷孔菌(Daedalea dickinii)；11.红肉拟层孔菌(Fomitopsis rosea)；12.哈尔蒂木层孔菌(Phellinus hartigii)；13.桦褶孔菌(Lenzites betulina)；14.灰白栓菌(Trametes incana)；15.松针层孔菌(Phellinus pini)；16.茶色拟迷孔菌；17.云芝(Coriolus versicolor)；18.红缘拟层孔菌(Fomitopsis pinicola)；19.松木层孔菌(Phellinus pini)；20.平盖灵芝(Ganodema applanatum)；子实体均采自黑龙江省伊春乌伊岭，菌种由徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室分离鉴定。

1.2 实验用细胞

人非小肺癌细胞NCI-H460、人肝癌细胞HepG2、人肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.3 试剂与仪器

由图1可见，不同多孔类真菌子实体乙醇提取物清除DPPH自由基的能力均随质量浓度的增大而增强。各多孔类真菌清除DPPH自由基能力的大小顺序为：榆生拟层孔菌＞松针层孔菌＞松木层孔菌＞红肉拟层孔菌＞哈尔蒂木层孔菌＞红缘拟层孔菌＞平盖灵芝＞桦剥管孔菌＞绒毛栓菌＞毛栓菌。其中红肉拟层孔菌、松针层孔菌、茶色拟迷孔菌、松木层孔菌4株多孔类真菌子实体乙醇提取物有较强的DPPH自由基清除能力，其EC50值均在0.5mg/mL左右。

IBE2000显微镜 Coic公司；CO2细胞培养箱 日本三洋公司；SpectroMax M2荧光检测仪 Molecular Device公司；96孔细胞培养板 美国Gibco公司。

采用Alamar Blue法[10-11]检测体外抗肿瘤细胞活性。人非小肺癌细胞NCI-H460，人肝癌细胞HepG2，人肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu于37℃、5% CO2的条件下在含10% 小牛血清的RPMI 1640培养液中培养，取对数生长期的细胞用0.25g/100mL胰蛋白酶消化后制成细胞悬液浓度约为5×104个/mL，96孔细胞培养板中每孔加100μL，空白组加100μL不含细胞的培养基，放入细胞培养箱中过夜，使细胞贴壁。然后加100μL样品于实验组中，空白组补加100μL培养基，对照组加入100μL含相同浓度DMSO的培养基。培养48h后，弃去培养液，用PBS洗涤两次。Alamar Blue贮存液用培养基以1:10比例稀释后，每孔加200μL，4h后将培养板放于570nm的激发波长和590nm的发射波长下检测荧光值。抗癌药物的活性以IC50衡量，IC50为抑制率为50%时药物的浓度。按式(2)计算抑制率。

1.4 多孔类真菌乙醇提取物的制备

从表2可以看出，20株多孔类真菌子实体乙醇提取物对两株细胞均具有一定的抗肿瘤活性，在500μg/mL时，其中桦剥管孔菌、绒毛栓菌、钹孔菌、岛生异担子菌、榆生拟层孔菌、松针层孔菌、松木层孔菌、红缘拟层孔菌、松木层孔菌、平盖灵芝子实体乙醇提取物的抗肿瘤效果较强，抑制率均在90%左右，而其对应的菌丝体乙醇提取物抗肿瘤活性较弱，但部分多孔类真菌发酵液有很好的抗肿瘤活性，这也进一步说明在液体发酵过程中，部分菌丝体的代谢产物溶解于发酵液中。

由表4可知，灭菌温度85℃时，酸奶凝乳不完全且质地较稀；灭菌温度90℃时，酸奶凝乳均匀且质地黏稠适当；灭菌温度95℃时，酸奶凝乳不均匀且有乳清析出。因此，产品的最佳灭菌温度为90℃。

1.5 抗氧化活性实验

式中：F代表对照组的荧光值；F0代表样品组的荧光值；F1代表空白组的荧光值。

1.6 细胞培养与体外抗肿瘤细胞活性实验

不想当将军的士兵不是好士兵，一个有上进心的员工，必然会希望自己为企业带来更高的价值，付出更多的努力来谋求更高的待遇。如果企业不能够给员工一个良好的发展前景，那么员工的工作积极性势必会消耗殆尽。例如酒店餐饮部，员工从一线服务员做起，然后是主管、领班、西餐厅经理，餐饮部经理。如果五星级酒店的领导职位没有空缺，就缺少升职的空间，酒店中基层员工的需求量很大，但管理层相对来说流动率较低。因此，许多员工在基层岗位积累足够多的经验，如果没有升职的机会就会选择跳槽。

采用DPPH自由基清除法[9]。将乙醇提取物用50%的乙醇配成5、2.5mg/mL的受测液备用。取100μL的200μmol/L DPPH乙醇溶液和100μL的受测液加入96孔板中，混匀，室温下放置30min后，在517nm波长处测吸光度(A0)，同时测定100μL DPPH溶液+100μL 50%乙醇混合液的吸光度(A1)和100μL受测液+100μL 50%乙醇混合液在波长517nm处的吸光度(A2)。EC50是清除活性为50%时对应的样品浓度。按式(1)计算DPPH自由基清除率。

准确称5g多孔类真菌子实体和菌丝体，粉碎，按料液比1:20(m/V)加入75%乙醇溶液100mL，在55℃超声提取50min，重复两次，过滤所得液体减压浓缩去除乙醇得浸膏，4℃保藏备用。样品在细胞实验前用二甲亚砜(DMSO) (各实验组终体积分数为0.5%助溶，再以RPMI 1640培养液稀释至各实验浓度，对照组中加入相同浓度的DMSO。

2 结果与分析

2.1 20种多孔类真菌子实体和菌丝体乙醇提取物对DPPH自由基清除作用

DPPH自由基是一种比较稳定的自由基，本身为紫色物质，乙醇溶液的最大吸收峰处波长为517nm。DPPH自由基可以接受抗氧化剂提供的氢，使溶液紫色褪去，导致吸光度的变化，因而可以用于抗氧化活性的检测，即DPPH法，与其他抗氧化检测方法相比，该方法用时短且重复性好，因而被广泛应用[12]。

表1 20种多孔类真菌子实体与菌丝体乙醇提取物对DPPH自由基的清除率比较Table 1 Comparison of scavenging activity of ethanol extracts from mycelia and fruit bodies of 20 polypores on DPPH free radicals%

从表1可以看出，20株多孔类真菌子实体、菌丝体乙醇提取物清除DPPH自由基的能力不同。其中桦剥管孔菌、绒毛栓菌、毛栓菌、榆生拟层孔菌、红肉拟层孔菌、哈尔蒂木层孔菌、松针层孔菌、红缘拟层孔菌、松木层孔菌、平盖灵芝子实体乙醇提取物清除DPPH自由基的能力较强，在质量浓度5mg/mL时，清除率均超过70%。而岛生异担子菌、毛栓菌、红缘拟层孔菌菌丝体乙醇提取物在质量浓度5mg/mL时，清除率均超过60%。从表1还可以看出，20种子实体乙醇提取物清除自由基活性大部分强于菌丝体，只有岛生异担子菌、毛栓菌、茶色拟迷孔菌、云芝菌丝体乙醇提取物清除DPPH自由基的能力高于它们相应的子实体乙醇提取物。

对其中清除DPPH自由基能力较强的10株多孔类真菌子实体乙醇提取物进行复测，对DPPH自由基清除能力如图1所示。

图1 10株多孔类真菌子实体乙醇提取物的DPPH自由基清除活性Fig.1 Scavenging activity of ethanol extracts from fruit bodies of 10 polypores fungi on DPPH free radicals

Alamar Blue 美国Sigma公司；胎牛血清 杭州四季青公司；青霉素、链霉素、胰蛋白酶 南京生兴生物技术有限公司；RPMI 1640 美国Gibco公司；DMSO及其他试剂均为国产分析纯。

2.2 20种多孔类真菌乙醇提取物及发酵液对肿瘤细胞增殖的影响

采用NCI-H460和HepG2两株癌细胞，通过Alamar Blue法对20种多孔类真菌子实体乙醇提取物、菌丝体乙醇提取物及其相应的发酵液进行抗肿瘤活性检测，结果见表2。

图2 10株多孔类真菌子实体乙醇提取物对3株肿瘤细胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of ethanol extracts from 10 polypores fungi on proliferation of three cancer cell lines

多孔类真菌液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g，水1000mL；液体培养条件为：160r/min、26℃、10d后停止培养，收集菌丝并冷冻干燥。

表2 20株多孔类真菌子实体和菌丝体乙醇提取物及发酵液抗肿瘤活性比较Table 2 Comparison of anti-tumor effects of ethanol extracts from fermented mycelia and fruit bodies of 20 polypores fungi and fermentation broth

对具有较强抗肿瘤活性的10株多孔类真菌子实体乙醇提取物进行抗肿瘤活性复测，并检测了乙醇提取物对人肝癌细胞Bel-7402/5-Fu耐药株的细胞毒性。如图2所示，10株多孔类真菌子实体乙醇提取物对细胞株NCIH460、HepG2和Bel-7402/5-Fu均有较高的抗肿瘤活性，但对耐药细胞株的IC50值均略高于非耐药细胞株，且抗肿瘤活性与提取物质量浓度存在明显的量-效关系。其中钹孔菌、红缘拟层孔菌子实体乙醇提取物对3株癌细胞的IC50值均低于100μg/mL。

合规概念的使用始于会计金融领域。目前，合规风险指“不符合法律规定”所导致的风险，是企业在经营活动中，由于内部控制和治理机制不完善，企业活动未能与法律、法规、制度、政策、行业规则等有关规范保持一致，而可能面临主管或司法机关处罚的风险。

PJI分子生物学诊断方法有其独特的优点，如快速、低成本，不低于常规诊断方法的敏感性与特异性，不仅能诊断感染及其病原菌，而且可鉴定出抗生素耐药性基因，尤其适用于细菌培养阴性、近期使用抗生素、以及低毒力细菌感染的患者。但同时缺点也较为明显，如假阳性率较高、诊断局限于特定范围的细菌、需要特定的设备、不能提供药敏结果以直接指导临床抗生素应用等。但必须肯定的是，就目前PJI诊断治疗的临床研究来看，分子生物学诊断是PJI常规诊断方法的重要补充，有其特定的临床价值。

3 讨 论

自然界存在的真菌种类繁多，从这些真菌中是否能寻找到抗氧化和作用机制新颖的抗肿瘤成分是开发抗氧化、抗肿瘤新药的基础工作。过去对多孔类真菌抗肿瘤作用的报道中指出多孔类真菌具有抗肿瘤作用的活性成分，如桑黄中β-1,3-葡聚糖在C6有葡萄糖分支的具有较好的抗癌效果[13]。但也有报道指出在多孔类真菌中存在除多糖以外的抗肿瘤化合物。等[14]和Faldt等[15]从多孔类真菌中分离出麦角甾醇类衍生物及灵芝酸等羊毛甾烷类三萜化合物。Chieoko等[16]从一些真菌中分离出了一些具有较好抗氧化作用的化合物。综合国内外研究报道，多孔菌代谢产物的多样性表现为多糖、萜类、甾醇类、多肽、吡喃类化合物、黄酮和香豆素类化合物等结构类型，同时，这些多种结构类型的代谢产物具有抗肿瘤、抗氧化、护肝、抗炎、抗病毒、抗菌、抗虫、溶血和降低胆固醇等多种生物活性。

重视农村经济发展问题，关乎着我国社会主义现代化事业进程，影响着广大农民的收入水平。为此，我国要重视农村经济发展，把农村经济发展理念立于我国长远国家战略计划中，行于社会主义现代化建设进程中。只要国家、政府和人民凝聚力量，齐心协力全方位搞农村经济发展，一定能够振兴乡村经济，推进新农村建设，确保农民收入持续增长，从而不断提升农民生活质量和生活水平。

应用降脂汤结合针灸治疗高脂血症127例患者，其疗效为显效92例，有效28例，无效及恶化7例。总有效率94.5%。

本实验采用清除DPPH自由基法和Alamar Blue法对供试的20种多孔类真菌子实体和菌丝体乙醇提取物进行检测筛选，为今后分离出具体活性物质提供依据，结果表明其中10株多孔类真菌子实体乙醇提取物具有较好的DPPH自由基清除能力或抗肿瘤活性，并对它们抗氧化和抗肿瘤活性的强弱进行了比较，其中有8株多孔类真菌子实体乙醇提取物既具有较好的DPPH自由基清除能力又有较强的抗肿瘤活性。结果还表明，20种多孔类真菌子实体的活性大部分强于菌丝体，这可能与液体发酵过程中，菌丝体代谢的部分活性物质溶解于发酵液中或发酵条件如培养基、发酵时间、溶氧量等对多孔类真菌活性物质的产生与积累有一定的关系。对于本实验中子实体乙醇提取物的活性较高，而对应的菌丝体乙醇提取物和发酵液活性较低的菌株，发酵条件有待进一步优化。优化后可以进行深层发酵来获得大量菌丝体及发酵液。由此，不论从经济成本还是从药理活性上看，深层发酵获得要比天然野生的多孔菌更具有开发利用的价值，也可以解决近年来过度采集所造成的自然资源不足的问题，这方面的工作目前也正在进行。

[1] 张华, 姜成林, 徐丽华. 药用微生物资源[J]. 微生物学通报, 2004, 31(2): 152-153.

[2] 黄年来. 俄罗斯神秘的民间药用真菌: 桦褐孔菌[J]. 中国食用菌,2002, 21(4): 7-9.

[3] 孙培龙, 徐双阳, 杨开. 珍稀药用真菌桑黄的国内外研究进展[J]. 微生物学通报, 2006, 33(2): 119-123.

[4] 秦葵, 张书锋. 灵芝抗肿瘤药理研究进展[J]. 白求恩军医学院学报,2004, 2(4): 237-239.

[5] XIE Chun, KOSHINO H, ESUMI Y, et al. Vialinin A, a novel 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenger from an edible mushroom in China[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry,2005, 69(12): 2326-2332.

[6] 王晓玲, 刘高强, 周国英, 等. 紫芝酸性三萜类化合物体外抑癌和抑菌作用的研究[J]. 菌物学报, 2009, 28(6): 838-845.

[7] CHEUNG L M, CHEUNG P C K, OOI V E C. Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts[J]. Food Chemistry, 2003,81(2): 249-255.

[8] 郑琳, 黄荫成, 高清祥, 等. 白阿魏蘑粗提物抗氧化和抗肿瘤活性研究[J]. 菌物学报, 2005, 24(1): 71-78.

[9] 赵俊霞, 袁广峰, 徐瑞雅, 等. 草菇培养物中粗三萜和黄酮含量及抗氧化抗肿瘤活性研究[J]. 菌物学报, 2007, 26(3): 426-432.

[11] HAMID R, ROTSHTEYN Y, RABADI L, et al. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throught-put screening[J]. Toxicology In Vitro, 2004, 88(5): 703-710.

[12] 武守华, 张晓君, 张平, 等. 四种子囊菌甲醇提取物的抗氧化活性研究[J]. 菌物学报, 2010, 29(1): 113-118.

[13] KIM Y S, PARK K S, PARK H K, et al. Compositional sugar analysis of antitumor polysaccharides by high performance liquid chromatography and gas chromatography[J]. Arch Pharm Res, 1994, 17(5): 337-342.

[15] FALDT J, JONSELL M, NORDLANDER G, et al. Volatiles of bracket fungi Fomitopsis pinicola and Fome fomentarius and their functions as insect attractants[J]. Journal of Chemical Eclolgy, 1999, 25(3): 567-590.

[16] CHIEOKO K, MANABU N, KIHARU I, et al. beta-Hydroxyergothioneine,a new ergothioneine derivative from the mushroom Lyophyllum connatum,and its protective activity against carbon tetrachloride-induced injury in primary culture hepatocytes[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2005, 69(2): 357-363.

Comparisons on Antioxidant and Anti-tumor Activity of Ethanol Extracts from 20 Polypores Fungi in vitro

CHEN Yong-qiang，CHEN Xian-hui，SUN Yong，MIAO Qian，WANG Li，JIANG Ji-hong*
(Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plants of Jiangsu Province, Xuzhou Normal University, Xuzhou 221116, China)

The antioxidant activities of ethanol extracts from the mycelia and fruit bodies of twenty polypores fungi were evaluated by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging method. Meanwhile, these extracts were tested for their anti-tumor activities by Alamar Blue method. The results showed that the DPPH free radical scavenging and anti-tumor activities of the extracts from fruit bodies of each of these fungi were significantly higher than those of the extracts from mycelia.A DPPH radical scavenging rate of 70% was observed for the ethanol extract of fruit body at a concentration of 5 mg/mL, and the inhibition rates of the ethanol extract against two cancer cell lines such as non-small lung cancer cell NCI-H460 and human hepatoma cell HepG2 were both around 90% at 500 μg/mL. In addition, compared with the normal cell lines, a slightly low inhibition rate of the ethanol extract on drug-resistant cells such as Bel-7402/5-Fu was also observed.

polypores；antioxidation；DPPH free radical； anti-tumor activity

TS201.2

A

1002-6630(2011)05-0027-05

2010-06-14

国家“863”计划项目(2007AA021506)；江苏省高校自然科学重大基础研究项目(08KJA350001)

陈永强(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：chenyongqiang_163@163.com

*通信作者：蒋继宏(1962—)，男，教授，博士，研究方向为资源微生物及生物技术。E-mail：jhjiang@xznu.edu.cn