负载空间链四(6-氨基己酸磺酰基)铝氯酞菁聚合物纳米粒子的合成及其离体光动力活性

陈莉莉 彭亦如＊， 林萍萍 阙寿林 黄丽珊 陈奎治 徐国兴

(1福建师范大学化学与材料学院，福州 350007)(2福建医科大学附属第一医院，福州 350005)

负载空间链四(6-氨基己酸磺酰基)铝氯酞菁聚合物纳米粒子的合成及其离体光动力活性

陈莉莉1彭亦如＊，1林萍萍1阙寿林1黄丽珊1陈奎治1徐国兴2

(1福建师范大学化学与材料学院，福州 350007)(2福建医科大学附属第一医院，福州 350005)

以四磺酸铝氯酞菁1为原料，采用氨基转化法，经磺酰氯化和Hinsberg磺酰胺化反应合成四磺酰铝氯酞菁2和四(6-氨基己酸磺酰基)铝氯酞菁3，产物结构经元素分析，IR，1HNMR和MS-ESI表征。3在磷酸盐缓冲溶液中与两亲嵌段共聚物聚乙二醇-聚-L-赖氨酸(PEG-b-PLL)通过静电自组装，形成负载3的聚合物纳米粒子3/m。原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)表明3/m具有球形核壳结构，直径约为10～20 nm。紫外-可见吸收光谱和荧光光谱法研究了3/m的光物理性质。通过对不同孵育时间的人脐带血内皮细胞(HUVEC)摄取药代动力学测定3/m细胞摄取率和MTT法评价3/m的离体光动力活性，相对自由酞菁3，3/m的细胞摄取率大大提高，且提前1 h达到最高浓度，而且细胞抑制率明显增大，约为3的2倍。

酞菁铝；空间链；聚合物纳米粒子；聚乙二醇单甲醚-聚-L-赖氨酸；合成；光动力活性

光动力疗法是一种治疗肿瘤及非肿瘤性疾病的新方法[1-3]。光动力疗法的关键是光敏剂。迄今为止，酞菁配合物被认为是很有潜力的第二代光敏剂[3-4]。但是,由于酞菁分子间强的π-π疏水作用，导致它们容易聚集，从而降低其单线态和三线态氧的量子产率和荧光寿命，从而降低其光敏效果[5]。本课题组的主要研究工作是合成用于治疗脉络膜新生血管类疾病的酞菁光敏剂。考虑到在金属酞菁配合物周边引入长的空间链，不仅可以增加其作用范围，而且其疏水的空间链也将有利于穿过细胞膜，提高光动力活性，同时，亲水性的端基将有助于其与白蛋白结合和在体内运输。此外，亲水性端基还有助于其与带有相反电荷的两嵌段共聚物PEG-b-PLL通过静电作用形成聚合物纳米粒子[6-9]。

第二代光敏剂的主要缺点是对新生组织的选择性较弱。第三代光敏剂是在第二代光敏剂上粘附或引入一些具有生物特性的化学装置，这种 “化学装置”可将光敏剂运输或靶对指定的新生组织活细胞[10]，进一步提高了对新生组织的选择性。目前可以作为化学装置可以是脂质体、聚合物胶束和胶囊和蛋白质等等。

聚合物胶束已作为一种有效靶向新生组织的载药方法引起国内外医药界人们的广泛关注，特别是具有生物相容性和生物可降解性的两亲嵌段共聚物。两亲性嵌段共聚物在水溶液中自发组装成具有核-壳纳米胶束来完成对药物的包裹和增溶[11]。当共聚物与药物相互作用时，疏水链段与药物通过疏水相互作用而聚集形成内核。亲水性PEG在核的外围形成栏栅状壳，阻止疏水内核之间的相互作用。嵌段共聚物胶束尺寸可控制在10～200 nm，这种尺寸使纳米粒子通透性好，能进入许多大粒子无法进入的组织或越过的屏障，在新生组织中富集。另外，带有PEG壳的聚合物纳米胶束已被证实能明确有效地富集在实体肿瘤中[12-13]。

鉴于上述考虑，本文设计合成了端基为亲水羧基空间链为疏水性烷基的金属酞菁配合物3，以两亲嵌段共聚物聚乙二醇单甲醚-聚L-赖氨酸(PEG-b-PLL)为药物载体，其与3通过静电自组装形成负载3的聚合物纳米粒子3/m。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

6-氨基己酸(深圳迈瑞尔化学技术有限公司)；33%溴化氢乙酸溶液(上海百灵威技术有限公司)；聚乙二醇单甲醚 (Fluka，A.R.)；Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸(天津阿法埃莎化学有限公司)；三光气(天津阿法埃莎化学有限公司)，四磺酸铝氯酞菁由本课题组合成，其余试剂均为市售化学纯和分析纯。

Vario ELⅢ型元素分析仪(德国Element公司)；PE-983G型傅立叶红外光谱仪(英国Perkin-Elmer公司)；UNITY500型核磁谱仪(美国 Varian公司)；LCQ Deca XP Max型质谱仪(美国 Finnigan公司)；Cary50型UV-Vis吸收光谱仪(美国 Varian公司)；FL900/FS920型稳态和瞬态荧光光谱仪 (英国Edinburgh分析仪器公司)；Nano Scope IIIa原子力显微镜(Digital Instrument公司)；JBM-1010透射显微镜(日本电子公司)。

1.2 实验部分

3的合成路线如图1所示。

图1 3的合成路线Fig.1 Scheme for synthesis of compound 3

1.2.1 2 的合成[14]

氮气保护下，在装有氯磺酸(15 mL)的三颈烧瓶中缓慢加入 1(1 g，1.16 mmol)，混合均匀，在 135～150℃下搅拌回流6 h，冷却至80℃后，缓慢滴加氯化亚砜(3 mL)，继续反应3 h，冷却至室温，慢慢倒入250 mL冰水中，有大量的絮状深蓝色的沉淀产生，静置，过滤，滤饼依次用稀盐酸、水洗至溶液呈中性，过滤，真空干燥，得深蓝色固体产物，产率90%。熔点大于350℃。

元素分析：按(C32H12N8S4O8Cl5Al·6H2O)的计算值(%):C(35.68)，H(2.25)，N(10.40); 实 际 值 (%):C(36.29)，H(2.54)，N(10.24)。

IR/cm-1:3 400，1 606，1 502，1 401，1 377，1 324，1 172，1 074，1 026，922，756，680。1H NMR(DMSO-d6,400MHz，δ/ppm)：9.86 (s,4H，ArH)，9.72 (s,2H,ArH)，9.63(s，2H，ArH)，8.69(s，4H，ArH)。 ESI-MS(m/z)：935[M+2H]-。

1.2.2 3 的合成

将 2(0.97 g，1 mmol)缓慢地加入到溶解 6-氨基己酸(1 g，8 mmol)的水溶液中，碳酸钠调节pH值为8～9，室温搅拌反应至无气泡。 用 0.1 mol·L-1的稀盐酸溶液调节pH值到7，旋转蒸发，95%的乙醇水溶液重结晶2次，得深蓝色固体，产率63%。熔点＞350 ℃。 元素分析：按(C56H60N12S4O16AlCl·2H2O)的计算 值(%)：C(48.60),H(4.66),N(12.15);实 际 值(%)：C(48.31),H(4.45),N(12.42)。

IR/cm-1：3 424,2 931,2 856,1 624,1 560,1 385,1318,1192,1143,1108,1028,922,835,690。

1H NMR (D2O,400MHz, δ/ppm)：8.2～10.0(m,12H,ArH),2.9(s,2H,CH2),2.17(s,2H,CH2),1.66(s,2H,CH2),1.57(s,2H,CH2),1.36(s,2H,CH2)。 MS(MALDI-TOF)(m/z),1346[M+1]+。

1.2.3 PEG-b-PLL 的合成

两亲嵌段共聚物聚乙二醇-聚L-赖氨酸按文献[15-16]合成。IR/cm-1:3263，3050，2932，1967，1695，1 617，1 530，1 390，1 287，1 246，1 080～1 149，950，915， 884，778，709，627。1H NMR(D2O，400 MHz，δ/ppm)：4.7,4.3(t,α-CH)，3.7(m,CH2-CH2-O-,4H)，3.0(t,ε-CH2)，1.7～1.4(m,β-CH2，γ-CH2和 δ-CH2)

1.2.4 3/m 的制备

用Na2HPO4(10 mmol)溶液配制成3的浓度为1×10-5mol·L-1, 取 13.8 mL 该溶液， 然后加入溶有10 mg PEG-b-PLL 的 6.2 mL NaH2PO4(10 mmol)溶液，混合均匀。混合后溶液的pH值为7.4。

1.2.5 形态观察

将少量自组装后样品滴加到云母片上，自然风干，采用Nano Scope IIIa原子力显微镜观察样品的形貌。

将少量自组装后样品滴加到铜网上，采用JBM-1010透射电镜观察样品形貌。

1.2.6 紫外-可见吸收光谱

25℃下， 以 pH=7.4的 NaH2PO4-Na2HPO4(PBS)缓冲溶液为溶剂，190～900 nm扫描样品吸收光谱。

1.2.7 荧光光谱性质

25℃下，以PBS 缓冲溶液为溶剂，以610 nm为激发波长，观测酞菁体系在600～800 nm之间的发射光谱。通过氢气纳米闪烁灯采用350 nm波长激发，测定酞菁的荧光衰减曲线。荧光衰减曲线根据拟合方程 Fit=A+B1e-t/τ1+B2e-t/τ2+B3e-t/τ3+B4e-t/τ4进行双曲线拟合得到荧光寿命。

1.2.8 3/m 细胞摄取药代动力学

正常人人脐带血内皮细胞(HUVEC)的培养方法见文献[17]。

开启紫外可见分光光度仪，先用2.0%TritionX-100 调零， 分别加入 10 μg·mL-13 和 3/m 1 mL，在300～800 nm进行吸收光谱扫描，找到吸收峰，然后在这个峰值作点扫描，分别做出一条标准曲线。用传至第三代的人的HUVEC细胞，置六孔板培养，每孔1.0 mL， 细胞密度为 5×106mL-1， 酞菁终浓度为20 mol·L-1，对照组加入同体积的PBS溶液，37℃，5%CO2，饱和湿度的 CO2培养箱中避光孵育。0.5、1、2、3、4 h各收集一组细胞(各组设 3个平行孔)。 用PBS洗涤细胞2次后，加入1 mL细胞裂解液(2.0%TritionX-100)，吹打混匀，光学显微镜下检测未见完整细胞。细胞裂解产物于低温离心机4℃，高速离心30 min，取上清，用紫外可见分光光谱仪检测细胞内酞菁的量。

1.2.9 离体光动力效果评价

1.2.9.1 PDT 处理

用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬HUVEC细胞，密度为1×106mL-1，加入终浓度为10 μg·mL-1的3和3/m，孵育4 h后光照；光照条件：由LD-670半导体激光机(由天津医科大学激光医学研究室研制)输出的670 nm激光以600 mW·cm-2的功率密度，按能量密度为50 J·cm-2照射。同时设立光对照组(不加光敏剂，加入相同体积PBS，孵育 4 h后光照)、含10 μg·mL-13和 3/m 的对照组(仅与光敏剂孵育4 h，不光照)。

1.2.9.2 MTT 比色法

即PDT处理后的HUVEC细胞，接种于96孔培养板，每组设3个平行孔，实验重复3次。置37℃，5%CO2，饱和湿度的CO2培养箱中孵育48 h，用氮蓝四唑盐(MTT)比色法检测HUVEC细胞的增殖能力。步骤如下：吸去含有胎牛血清的培养液，每孔加入 20 μL MTT(5 mg·mL-1)，加无血清培养基至200 μL 培养 4 h 后，弃上清，加入 20 μL DMSO 溶解结晶。在酶标仪上用波长490 nm测OD值，计算抑制率I。

2 结果与讨论

2.1 合成条件

2的合成是本实验的关键。在氯磺化反应中，1与氯磺酸的物质的量比不同，生成含不同取代基数目的酞菁磺酰氯的混合物。为了使反应进行完全，在反应后期加入二氯亚砜。实验中考察了反应温度和反应时间对2收率的影响，结果表明，合成2的最佳反应条件为135～150℃。3的合成反应机理为SN2亲核取代。水溶液中该反应存在竞争性的水解反应，为防止同时发生氨化和水解反应，2应缓慢加入溶液中，需控制pH=8～9，且温度低于25℃。

2.2 形态表征

图2为两亲嵌段共聚物PEG-b-PLL在水溶液中自组装形成聚合物纳米胶束的AFM和TEM图，胶束呈现球形，直径约20～60 nm。

图2 PEG-b-PLL的AFM图(A)和TEM图(B)Fig.2 AFM(A)and TEM(B)images of PEG-b-PLL

图3是3/m的AFM和TEM图，负载3的聚合物纳米粒子呈球形,从放大图可看出具有明显的核壳结构,直径约为10～20 nm。

图3 3/m的AFM图(A)和TEM图(B)Fig.3 AFM(A)and TEM(B)(The enlarged image was inserted)images of 3/m

2.3 紫外-可见吸收光谱

2.3.1 AlPc(COOH)4和配合物 3 在水溶液中的紫外-可见吸收光谱

图4为配合物3和无空间链取代酞菁AlPc(COOH)4在水溶液中的UV/Vis图。3的Q带最大吸收峰位于682 nm。在水溶液中，3主要以单体形式存在，而AlPc(COOH)4则以单体和二聚体共存形式存在。因此，相对AlPc(COOH)4，3在水溶液中的聚集效应明显降低，这说明空间链在一定程度上可以有效阻止聚集体的形成。

2.3.2 3和 3/m 的紫外-可见吸收光谱

图5(A)为3和3/m的紫外-可见吸收光谱图，酞菁3在Q带出现2个吸收峰，分别位于682和645 nm。其中682 nm为单体吸收峰，而645 nm为二聚体吸收峰，表明3在水溶液中主要以单体形式存在。而形成聚合物纳米粒子后，只有一个吸收峰，即最大吸收峰位于644 nm，表明3在聚合物胶束内主要以二聚体形式存在[5,18]，而且相对3的二聚体吸收峰，3/m的吸收峰蓝移。这可能是由于3与嵌段共聚物之间存在相互作用形成聚合物纳米粒子。形成聚合物纳米粒子后，酞菁在胶束内的局部浓度过大，因此酞菁主要以二聚体形式存在。

图4 3(a)和AlPc(COOH)4(b)在水溶液中的UV-Vis吸收光谱Fig.4 UV/Vis spectrum of 3(a)and AlPc(COOH)4(b)withdifferent concentration in water.From up to down,the corresponding concentration(μmol·L-1)is 40,60,80,100,120,140,respectively

2.4 荧光光谱

图5(B)和5(C)分别为3和3/m的荧光光谱图和相应的荧光衰减曲线图。从图5(B)可以看出，将3包裹进入聚合物纳米载体后，3/m的荧光强度大大降低,这可能是由于形成聚合物纳米粒子后，每个聚合物纳米粒子中包含的酞菁数目增多，酞菁的局部浓度过大，使得二聚体数目增加，荧光强度急剧下降。但是，形成聚合物纳米粒子后，酞菁分子间非辐射能量转移效应降低，单线激发态寿命从5.18 ns增加到5.36 ns。

图5 3(-)和3/m(--)在PBS缓冲溶液中的紫外-可见吸收光谱(A)、荧光光谱(B)、荧光衰减曲线(C)Fig.5 UV/Vis spectra(A)，fluorescence spectra(B)and fluorescence decay curves(C)of 3(-)and 3/m(--)

2.5 不同孵育时间HUVEC细胞摄取3和3/m的药代动力学

从图6可以看出，与自由酞菁3相比，聚合物纳米粒子3/m的细胞摄取率大大提高，而且提前1 h达到最高浓度。

图6 不同孵育时间HUVEC细胞摄取3(■)和3/m(●)的量Fig.6 Time-dependent uptake amount of 3(■)and 3/m(●)in HUVEC cell

2.6 离体光动力活性

HUVEC细胞的离体光动力效果通过MTT法测定。表1为细胞存活率与光动力条件的关系。3和3/m在黑暗条件下几乎没有毒，相对自由酞菁3，3/m的细胞抑制率明显增大，其离体光动力活性约为3的2倍。这可能是由于形成的聚合物纳米粒子小，通透性好，能进入许多大粒子无法进入的组织或越过的屏障，能明确有效地富集在HUVEC细胞中[12-13,19]。

表1PDT后48 h HUVEC细胞的MTT法检测结果Table 1 Results of MTT method in 48 h after PDT of HUVEC cells

续表1

3 结 论

合成并表征了一种新型空间链取代四(6-氨基己酸磺酰基)铝氯酞菁3。3在PBS缓冲溶液中与PEG-b-PLL通过静电作用自组装成聚合物纳米粒子3/m。3/m为具有核壳结构的直径约为10～20 nm的球形纳米粒子。与自由酞菁3相比，形成负载3的聚合物纳米粒子后，3/m主要以二聚体形式存在，荧光强度降低，荧光寿命增长。将3包裹进入聚合物纳米胶束后，不同孵育时间HUVEC细胞摄取率大大提高，细胞光动力活性显著增加。这说明通过静电作用自组装形成的聚合物纳米粒子3/m在光动力治疗药物的应用方面比自由金属酞菁3具有更显著的离体光动力疗效。

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Synthesis of Polyion Micelle Incorporating Tetra-(6-carboxylic aminohexanoicsulfonyl)Phthalocyanine Aluminum(Ⅲ)and Its in vitro Photodynamic Therapy Efficacy

CHEN Li-Li1PENG Yi-Ru＊,1LIN Ping-Ping1QUE Shou-Lin1HUANG Li-Shan1CHEN Kui-Zhi1XU Guo-Xing2
(1College of Chemistry and Materials Science,Fujian Normal University,Fuzhou 350007,China)(2Affiliated First Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China)

Tetrachlorosulfonyl phthalocyanine aluminium (2)and tetra (6-carboxyl-aminohexanoicsulfonyl)phthalocyanine aluminium (3)were synthesized from (1)via sulfonylic chlorization and amidation reaction.The structures of above compounds were characterized by1H NMR,IR,MS and elemental analysis.The polymeric micelle (3/m)was formed via an electrostatic interaction of anionic phthalocyanine aluminum and poly(ethylene glycol)-poly(L-lysine)block copolymers(PEG-b-PLL)in PBS buffer solution.AFM and TEM showed that 3/m formed spherical nanoparticles with a diameter of 10～20 nm.The photophysical properties of 3/m were changed compared to that of compound 3.The time-dependent uptake amount of 3/m in HUVEC cell showed that the uptake amount of 3/m was significantly increased and reached peak value by ahead of an hour compared with that of 3.The in vitro photodynamic therapy efficacy of 3 and 3/m were evaluated by MTT methods.The results indicated that the in vitro photodynamic therapy efficacy of 3/m was ca.2 fold compared to that of free phthalocyanine 3.

phthalocyanine aluminium;spacer chain;polyion micelle;poly(ethylene glycol)-poly(L-lysine)diblock copolymer;synthesis;photodynamic therapy efficacy

O611.4；R979.1

：A

：1001-4861(2011)02-0327-06

2010-06-28。收修改稿日期：2010-08-12。

国家自然科学基金(No.20604007)、福建省自然科学基金(No.2008J0078)和卫生部科学研究基金(No.WKJ2008-2-61)和福建省科技厅重点项目(2007I0013)资助项目 。

＊通讯联系人。 E-mail：yirupeng@fjnu.edu.cn