甲胎蛋白异质体3和高尔基体蛋白73检测在原发性肝癌诊断中的临床意义

赵建忠,李智山,许东强,洪 波

(襄阳市中心医院1.医学检验部;2.消化科,湖北 襄阳441021)

原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)指肝细胞或肝内胆管细胞发生癌变,是临床上常见的消化系统恶性肿瘤之一。我国是肝癌大国,也是全球肝癌发病率最高的国家,在常见肿瘤中仅次于肺癌居第二位,且发病率仍在呈上升势头[1]。由于肝癌起病隐袭,早期诊断困难,大多数患者在确诊时已达局部晚期或发生远处转移;因此早发现、早诊断、早治疗是提高肝细胞癌患者生存率的最佳途径[2]。

迄今为止,被广泛认可的原发性肝癌血清标志物是甲胎蛋白(AFP),但其在病毒性肝炎和慢性肝脏疾病中亦可见不同程度升高,临床检测的敏感度较低[3]。近年来,其它许多分子也相继被报道可以作为原发性肝癌早期诊断的肿瘤标志物,如甲胎蛋白异质体3(AFP-L3),异常凝血酶原(DCP),高尔基体蛋白 73(GP73),α-L-岩藻糖苷酶(α fu),磷脂酰肌醇蛋白多糖3(GPC3)等[4]。其中AFP-L3为肝癌细胞特有,而GP73在原发性肝癌组织中的表达敏感度高于AFP,因此他们被广泛用于原发性肝癌早期诊断[5-7]。本研究以原发性肝癌,肝硬化,慢性肝炎,健康对照样本为试验材料,测定血清中AFP-L3和GP7含量,评估它们在原发性肝癌诊断中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 资料

本研究共收集来自本医院2008年12月-2009年12月住院患者血清标本116例,年龄在20-69岁(48.63±13.79),其中男性76例,女性 40例。包括原发性肝癌45例,肝硬化35例,慢性肝炎36例。选择本医院同期体检健康者40例,排除相关肝病,平均年龄42.24±11.84岁。原发性肝癌诊断根据中国抗癌协会肝癌专业委员会(2001)修订的《原发性肝癌的诊断与分期标准》进行[8]。肝硬化和肝炎的诊断按照中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会(2000)联合修订的《病毒性肝炎防治方案》进行[9]。

1.2 主要试剂和仪器

耦联有小扁豆凝集素微球的AFP-L3亲和吸附离心管(南京英科新创),GP73蛋白酶联免疫吸附检测试剂盒(上海泛柯生物)。美国 BioTek公司ELX800酶标仪和 Bio-Rad 1575洗板机,美国雅培I2000全自动免疫分析仪及配套试剂。

1.3 检测方法

AFP-L3测定:按照甲胎蛋白异质体亲和吸附离心管说明书洗脱AFP-L3,洗脱液与原血清标本共同上机(雅培I2000全自动免疫分析仪)定量检测AFPL3和AFP,计算AFP-L3占总AFP的比例(%)。以AFP-L3(%)＞15%作为AFP-L3比值异常升高的阳性标准。

GP73测定:采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定GP73蛋白含量(ng/ml),严格按照试剂盒说明书操作。GP73含量＞100 ng/ml为阳性。

1.4 统计学处理

各组数据均以平均数(¯x)±标准差(s)表示。用SPSS17.0统计软件,对各组的肿瘤标志物浓度和阳性率进行F检验或 χ2检验;用受试者工作特征曲线(ROC曲线)自动分析AFP-L3和GP73血清检测对原发性肝癌诊断的敏感性、特异性、曲线下面积等指标。

2 结果

2.1 各组血清AFP-L3和GP73含量比较

本研究中各组血清AFP-L3和GP73含量检测结果见表1。AFP-L3比值(%)在肝癌组为15.60±5.28,显著高于肝硬化组(7.86±2.33)、肝炎组(7.27±2.43)和健康组(6.42±1.56);而在肝硬化组、肝炎组和健康组间无统计学上的差异(P＞0.05)。血清GP73含量(ng/ml)变化范围为38.06±7.03(健康组)-129.16±28.68(肝癌组),统计学上差异显著(P＜0.05)。肝硬化组和肝炎组GP73含量分别为87.27±16.44和76.44±18.19,显著低于肝癌组(P＜0.05),显著高于健康组(P＜0.05),但肝硬化组与肝炎组间差异不显著。

表1 各组血清AFP-L3和 GP73检测结果(±s)

表1 各组血清AFP-L3和 GP73检测结果(±s)

注:右上标中有相同字母的为均值差异不显著(P＞0.05)。

组别 n AFP-L3(%) GP73(ng/ml)肝癌组 45 15.60±5.28a 129.16±28.68a肝硬化组 35 7.86±2.33b 87.27±16.44b肝炎组 36 7.27±2.43b 76.44±18.19b健康组 40 6.42±1.56b 38.06±7.03c F检验 F=68.84 P＜0.05 F=133.40 P＜0.05

2.2 各组血清AFP-L3和GP73检测阳性率分布

各组血清AFP-L3和GP73检测阳性率检测结果见表2。AFP-L3比值阳性率在不同组间存在显著差异(P＜0.05),肝癌组(82.22%)显著高于其它组;健康组中没检测到AFP-L3比值阳性个体;肝硬化组和肝炎组的AFP-L3比值阳性率分别为17.14%和16.67%,与肝癌组和健康组差异显著(P＜0.05)。45例肝癌组中,GP73阳性率为86.67%,显著高于其它组(P＜0.05);健康组中也没检测到GP73阳性个体。肝硬化组和肝炎组的GP73阳性率分别为14.29%和11.11%。在45例肝癌患者中,AFP-L3和GP73均为阴性的有5例,即当AFP-L3与GP73联合检测原发性肝癌时,阳性率达到88.89%,但与单项检测结果比较差异不显著(P＞0.05)。

表2 各组血清AFP-L3和 GP73检测阳性率

2.3 ROC曲线分析

以各组血清AFP-L3(%)和GP73检测结果绘制受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC),见图1。AFP-L3(%)诊断原发性肝癌的ROC曲线下面积为0.933(95%的置信区间为:0.884-0.981);GP73诊断原发性肝癌的ROC曲线下面积为0.936(95%的置信区间为:0.896-0.975)。AFPL3诊断原发性肝癌的最佳临界值为10.32(%),其对应的敏感度性0.82,特异性为0.93,Youden指数0.75。GP73诊断原发性肝癌的最佳临界值112.13,其对应的敏感性为0.76,特异性为0.96,Youden指数0.72。

图1 AFP-L3与GP73诊断原发性肝癌的ROC曲线

3 讨论

已有的研究表明,单纯使用AFP监测原发性肝癌的发生、发展已经不能满足临床需要,很容易造成误诊,因此开发新的可靠分子标志物具有重要临床意义。AFP可分为小扁豆凝集素(LCA)非结合型(AFP-L1、AFP-L2)、LCA 结合型(AFP-L3),其中 AFPL1主要存在于良性肝病中,AFP-L2来自孕妇,AFPL3为肝癌细胞所特有;因此AFP-L3被广泛作为原发性肝癌的分子标志物[6,10]。贾志凌等(2010)研究发现,AFP-L3的诊断灵敏度是75.00%,特异度达到91.67%[11]。本研究在不同组中也发现,肝癌组的平均AFP-L3比值(%)与阳性率均显著高于其它各组(P＜0.05),支持可以作为原发性肝癌临床检测的有效分子标志物。ROC曲线分析,AFP-L3诊断原发性肝癌的最佳临界值为10.32(%),与目前采用的＜10.0的阳性标准相一致。

朱国民等(2010)应用双抗体夹心酶联免疫定量测定方法检测肝癌、慢性肝炎血清中GP73的含量,结果发现GP73可以作为恶性肝病的独立指标与AFP互补应用于临床[12]。机体正常情况下,GP73是高尔基体顺面膜囊上的一种整合膜蛋白,疾病状态时候GP73可从游离于胞内体以及细胞表面,其作为肝癌标志物的分子机制由 Bachert等(2007)报道[13]。本研究发现,与AFP-L3相比,原发性肝癌组中具有更高的GP73阳性率,而肝硬化组和肝炎组GP73的阳性率则低于AFP-L3。因此,血清中GP73含量可能是比AFP-L3更好的一个分子标志物,用于原发性肝癌的临床诊断。多个肿瘤分子标志同时检测被认为可以提高临床检测的敏感度。孔祥亘等(2011)发现,将血清中GP73和AFP-L3浓度两个指标结合在一起对原发性肝癌进行临床诊断,具有更高的灵敏度,可提高原发性肝癌的诊断率[7]。然而,本研究的结果发现,当AFP-L3与GP73联合检测原发性肝癌时,阳性率可达到88.89%,高于单独使用AFP-L3和GP73检测结果,但统计学上差异不显著(P＞0.05)。

本研究通过检测血清中AFP-L3和GP73浓度,探讨了它们作为原发性肝癌临床诊断分子标志物的可靠性,结果支持它们都具有较好的诊断效果,单独使用和二者联合检测的阳性率没有显著差异。本研究结果有助于提高原发性肝癌的诊断率,及早采取有效治疗措施改善患者预后。

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[9]中华医学会传染病与寄生虫病学分会和肝病学分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志,2000,8(6):324.

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