不同方法筛查RhD弱表达变异体

宋任浩,魏世锦,李荣秀,张香改

(1.河北省血液中心,河北石家庄050071;2.河北省柏乡县人民医院;3.河北省计划生育科学研究院)

人类红细胞Rh血型发现于20世纪40年代,是人类红细胞血型系统中最具多态性者[1]。Rh血型抗原具有较强的免疫原性,仅次于ABO血型系统而具有重要的临床意义。先后共发现了几十种Rh血型蛋白抗原,与临床相关的主要抗原为D、C、c、E和e等5种,其中以D抗原性最强,其临床意义也更为重要。Rh血型D抗原是导致产生Rh抗体、溶血性输血反应以及新生儿溶血症的主要红细胞抗原。根据红细胞表面RhD抗原数的多寡,RhD阴性以外的RhD表型可分为4类:(1)常见表型每个红细胞带有1万-3.3万个抗原;(2)罕见的Rh缺失型;(3)D-等表型红细胞表面RhD抗原数增加,可达7.5个万-20万个;(4)RhD抗原数量减少的变异体,又可分为部分D、弱D和DEL三类[2]。这些RhD弱表达变异体的检测及其在输血上的意义,也成为近年来免疫血液学领域中的研究热点之一[3,4],因此,我们应用常规的RhD表型鉴定方法对278名初筛为RhD阴性的献血者进行了试验,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂 抗球蛋白试剂(上海输血技术有限公司,批号20080901);抗 D(IgM+IgG)单克隆抗体混合试剂(加拿大Dominion Biologicals Led公司,批号NDMG05003);1%木瓜酶试剂(长春博德生物技术有限责任公司,批号20090801);单克隆IgM抗D(上海市血液中心,批号:20080513、20071210)单克隆IgM抗-C、IgM抗-c、IgM 抗-E、IgM抗-e(上海市血液中心,批 号 分 别 为:20071035、20080604、20080112、20090105);单克隆IgG型抗-D(Biotest公司,批号:1826010;Eryclone公司,批号:1538091;上海市血液中心,批号:20071616、20081226)。

1.2 研究对象 来自河北省血液中心站内、固定采血点和流动采血车无偿献血者标本5 8386份,初筛出278份RhD阴性,方法为微量板盐水法,表型分布见表1。

1.3 研究方法 对于初筛为RhD阴性的献血者标本分别采用木瓜酶法、间接抗球蛋白法和吸收放散法筛查RhD弱表达变异体。用IgG型抗-D加RhD阳性红细胞做阳性对照;经抗体筛选确定不含不规则抗体的AB型血清加2%O型标准红细胞悬液做阴性对照。试验选择条件参照文献[5]。

1.4 酶介质法 3%受检洗涤红细胞悬液1滴与4种不同来源及规格的抗D试剂混合液2滴混合,同时做阴阳对照。加入1%木瓜酶液1滴,120 g离心1 min,观察结果。

1.5 间接抗球蛋白试验(IAT) 3%受检洗涤红细胞悬液1滴与4种不同来源及规格的抗D试剂2滴混合,同时做阴阳对照。37℃/水浴孵育60 min,120 g离心1 min,生理盐水洗涤3次,弃去生理盐水,加抗球蛋白试剂1滴,混匀,120 g离心1 min,观察结果,凝集为阳性。

1.6 吸收放散试验 IAT确认阴性的标本进行吸收放散试验。将洗涤后的浓缩红细胞与4种不同厂家及规格的抗D试剂混合液等量混合,同时做阴阳对照。37℃水浴孵育60 min,生理盐水洗涤6次得压积细胞。取1体积压积细胞加1体积生理盐水混匀,2体积乙醚和氯仿的混合物,颠倒混匀10 min,1 300 g离心5 min,用清洁的吸管吸出底部的放散液,置37℃30 min,取上层放散液2滴加入3%O型RhD阳性红细胞1滴,置37℃30 min,生理盐水洗涤3次,去净上清后加1滴抗球蛋白试剂,离心,肉眼和显微镜下观察结果。

2 结果

见表1。实验结果显示,无偿献血者标本58 386份,微量板盐水法初筛出278份RhD阴性,RhD阴性率为0.48%。278份初筛为RhD阴性的献血者标本中,酶介质法和IAT分别筛查出13份和15份弱D/部分D,酶介质法比IAT少检出两例,但无统计学意义(P＞0.05),得出酶介质法不如IAT敏感的结论尚早,有待于大样本的进一步研究;在IAT确认的RhD阴性个体中,若采用更为敏感的吸收放散试验,仍有部分个体RhD抗原检测为阳性。

表1 278份初筛为RhD阴性的献血者标本弱D/部分D及DEL检出情况

3 讨论

酶试验有漏检弱D/部分D的可能,因此,当用酶试验检查发现与抗D不凝集时,不应轻率地定为RhD阴性。但更为敏感的吸收放散试验检出的弱D或部分D的临床意义有待于进一步研究。弱D/部分D红细胞与某批或几批抗-D试剂在盐水介质及酶介质法中不发生凝集,但在IAT中均可发生凝集,可将IAT视为弱D/部分D的确认试验。抗-D试剂应包括不同生产厂家或批号的抗-D血清3-5批。弱D/部分D型人经输注RhD阳性红细胞后可产生抗D抗体。所以患者为弱D/部分D型时应作RhD阴性论,应输RhD阴性血液;供血者为弱D/部分D型时应作RhD阳性论,不应当输血给RhD阴性的患者。DEL型红细胞表面D抗原数量比弱D型还要少,而且质量上也有变化,只能通过吸收放散(adsorption and elusion)试验才能检出,故名DEL[2]。对DEL型D抗原本质的研究尚不充分,初步研究显示某些DEL型红细胞D抗原缺失某些表位可以产生抗-D[6],因此DEL型患者输注RhD阳性红细胞、DEL型女性妊娠 RhD阳性胎儿将可能面临一定风险。国外已有DEL型胎儿或红细胞免疫RhD阴性孕妇和RhD阴性受血者由于输入Del表型血液,而产生抗-D的病例报道[3,6]。但目前国际上,包括我国均不检测DEL型,仍将其视为 RhD阴性受者或供者[7]。进一步研究阐明DEL型的性质,对于组织血源和临床实践具有重要意义。Shao[8]的研究表明DEL型多见于亚洲人群,其在IAT确认为RhD阴性的人群中约占10%-30%。本研究共筛查出DEL67例,在IAT确认为RhD阴性的人群中占25.5%,与Shao的研究结果相一致,其中最主要的表型为Dccee(82%)。

RhD阴性个体RHD基因具有多态性;在中国用RHD基因分型完全替代血清学检测RhD表型的条件尚未成熟[9],盐水法、酶介质法、IAT、吸收放散试验等常规血清学试验方法在筛查RhD弱表达变异体中的作用和地位不同。盐水法不能筛查RhD弱表达变异体,但可以初筛RhD的常见表型,可用微板法测定,操作简单快速,市场上有化学改性的Ig-GRh抗血清供应。用5种抗Rh分型血清抗C、抗c、抗D、抗E、抗e来检查红细胞抗原,理论上有 18种表现型。抗血清效价标准为抗D不低于64,其他不低于16。酶(木瓜酶或菠萝酶)可以破坏红细胞表面的唾液酸,使红细胞膜失去电荷,缩小红细胞间的距离;同时酶还可以部分地改变红细胞结构,使某些隐蔽的抗原得以暴露,增强凝集性而且对IgG的作用大于IgM,故有利于不完全抗体的检出,特别是对某些血型系统,如Rh、Kidd系统的抗体特别敏感,但对MNS、Fya、Fyb等抗原决定簇有破坏作用,不能用于检查此类系统,所以酶介质法不能用作抗体检查出的唯一方法。IAT虽较灵敏,但也有一定限度,据报告每个红细胞上至少要有500个IgG分子才能产生阳性反应;再加上抗人球蛋白试剂的质量及操作技术的制约,也影响其灵敏度。此外,本法操作复杂,不利于急诊检查和大批量的血库作业。DEL型红细胞膜D抗原非常弱,常规IAT测定为阴性,只能通过更为敏感的吸收放散试验才能检出。文献报告经不同血清学方法确定的RhD阴性血样用吸收放散试验筛选并确认的DEL型所占比例不尽一致,15%(79/515)[10]至63%(47/75)[11],有待于方法学的进一步研究。

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[2]赵桐茂.RhD抗原变异体及其在输血中的意义[J].中国输血杂志,2008,21(1):1.

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[5]中华人民共和国卫生部.中国输血技术操作规程(血站部分)[M].天津:天津科学技术出版社,1997,67-86.

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[7]章 旭,林凤秋,李剑平,等.DEL型个体抗体筛选的调查分析[J].中国输血杂志,2009,22(10):796.

[8]Shop CP,Mass JH,Su YQ,et al.Molecular background of Rh D-positive,D-negative,D(el)and weak D phenotypes in Chinese[J].Vox Sang,2002,83(2):156.

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