miR-106b在阿尔茨海默病中的作用机制

王海林，宗园媛，刘嘉琳，秦 川

(中国医学科学院医学实验动物研究所，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

miR-106b在阿尔茨海默病中的作用机制

王海林，宗园媛，刘嘉琳，秦 川

(中国医学科学院医学实验动物研究所，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

目的 探讨miR-106b在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)发病中的作用。方法 取3月龄和6月龄 APPswe/PSΔE9小鼠脑组织，进行 microRNA芯片的检测;利用 real-time PCR检测 3、6、9月龄 APPswe/PSΔE9小鼠脑组织中miR-106b的表达，对芯片检测结果进行验证;通过构建 miR-106b稳定转染细胞系和 miR-106b knockdown研究miR-106b与TGFBR2表达之间的关系;构建 TGFBR2 3’UTR-荧光素酶报告载体，验证 miR-106b是否可以直接调控TGFBR2蛋白的表达;采用Western blot的方法检测 APPswe/ΔPSΔE9小鼠和对照小鼠脑组织中TGFBR2蛋白的表达情况。结果 miR-106b在3月龄和6月龄AD模型小鼠脑组织中表达升高，在9月龄模型小鼠脑组织中表达降低;通过体外实验，我们发现miR-106b与TGFBR2蛋白的表达呈负相关;荧光素酶报告实验表明TGFBR2 3’UTR序列中包含miR-106b的结合位点;TGFBR2蛋白在3、6、9、12月龄 AD模型小鼠脑组织中表达均降低。结论 miR-106b可能通过调控TGFBR2蛋白的表达影响TGF-β信号通路，从而参与AD的发病。

microRNA;miR-106b;阿尔茨海默病;TGFBR2;APPswe/PSΔE9小鼠

1 材料和方法

1.1 microRNA芯片

μParafloTM microRNA微阵列基因表达实验和分析由LC Sciences公司提供。miRNA探针序列信息来自于Sanger miRbase Release 9.2版本数据库，每种探针至少重复3次。对于双色标记实验，将计算两种检测信号的比值(log2)和t-test的P值，以P＜0.01定义差异显著性表达。

1.2 转基因小鼠的鉴定

将转 APPswe基因和 PSΔE9基因的双转 C57/BL6小鼠和野生型 C57/BL6小鼠杂交，提取鼠尾DNA，PCR鉴定APPswe/PSΔE9双转基因小鼠的基因表型，筛选阳性小鼠进行进一步实验。APP基因PCR产物长344 bp，PS基因PCR产物长608 bp。

1.3 逆转录反应和real time PCR

利用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit(Ambion)提取3、6、9月龄 APPswe/PSΔE9双转基因小鼠和同月龄对照小鼠总 RNA，在紫外分光光度计上测浓度。利用 miScript Reverse Transcription Kit(Qiagen)将RNA逆转录为cDNA。Real-time PCR是利用miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen)进行的，以U6为内参。用delta-delta C(t)的方法和t-test对数据进行分析和统计学处理，以P＜0.05定义差异显著性表达。

1.4 mir-106b稳转细胞的构建

按照BLOCK-iTTMPol II miR RNAi Expression Vector Kit(invitrogen)的说明构建 miR-106b表达载体，所构建的miR-106b表达载体含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。SH-SY5Y 细胞用DMEM培养基进行培养，其中添加10%热灭活的胎牛血清和100 U/mL青链霉素，37℃，5%CO2孵箱中培养。转染前1d将细胞接种到24孔板，换成无抗生素的培养基，转染按照 Lipofectamine 2000(invitrogen)的说明书进行。转染后6 h将24孔板中的培养基换成全培养基。转染后第2天将24孔板的细胞用胰酶消化下来，按1∶10传到60 cm2培养皿中培养，在培养基中添加2 μg/mL的Blasticidin进行筛选。此后，每隔 3d换一次含 2 μg/mL的Blasticidin的培养基，连续培养2周，然后在荧光显微镜下挑选带GFP的阳性克隆，进行扩大培养。

1.5 miR-106b knockdown

针对miR-106b的LNA探针或对照探针购自Exqion公司。利用 Lipofectamine 2000 reagent(Invitrogen)将这两种探针分别转染至SH-SY5Y细胞中，探针的终浓度为80 nmol/L。转染48 h后，收集细胞，分析 miR-106b和TGFBR2蛋白的表达情况。

1.6 Western blot

利用RIPA裂解液从细胞和脑组织中提取总蛋白，蛋白上样量为 10～70 μg，利用 12%SDS-PAGE胶进行分离，然后将其转移至NC膜上，室温下用TBST配制的5%牛奶封闭1 h，与兔抗人TGFBR2抗体 (Abcam)进行杂交，室温下孵育2 h或4℃过夜，用TBST洗膜3次，与HRP标记的羊抗兔IgG和β-actin进行杂交，室温下孵育1 h，用 TBST洗膜3次，然后进行化学发光。

1.7 双荧光素酶报告检测

根据 Targetsan、Pictar、miRanda等靶基因预测软件，预测 mir-106b与 TGFBR2 3’UTR的结合位点。PCR扩增 TGFBR2的3’UTR(包含与 mir-106b的预测结合位点并带 Xho I和 Not I两个酶切位点)，将PCR扩增产物克隆到pMDTM18-T载体，命名为T-TGFBR2-3’UTR。突变预测与mir-106b结合位点的碱基，构建突变的pMDTM18-T载体。根据Targetsan的预测，TGFBR2与 mir-106b的结合位点有两个，因此我们分别构建了两个单突变pMDTM18-T载体和一个双突变pMDTM18-T载体分别命名为TTGFBR2-3’UTR-M1，T-TGFBR2-3’UTR-M2，T-TGFBR2-3’UTR-2M。psiCHECKTM-2载体(Promega)含有两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。将所构建的 T-TGFBR2-3’UTR，T-TGFBR2-3’UTRM1，T-TGFBR2-3’UTR-M2，T-TGFBR2-3’UTR-2M载体与psiCHECKTM-2载体进行Xho I和Not I双酶切实验，将野生型或者含有突变位点的TGFBR2的3’UTR克隆至psiCHECKTM-2载体的海肾荧光素酶开放读码框架的下游，构建含TGFBR2-3’UTR及突变的TGFBR2-3’UTR的荧光素酶报告载体，分别命名为 P-TGFBR2-3’UTR，P-TGFBR2-3’UTR-M1，PTGFBR2-3’UTR-M2，P-TGFBR2-3’UTR-2M。将所构建的荧光素酶报告载体与mir-106b质粒/对照质粒在HEK-293T细胞进行共转染，转染后48 h，用双荧光素酶报告检测试剂盒(Promega)及荧光素酶活性检测仪分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，并将海肾荧光素酶的活性用萤火虫荧光素酶的活性进行标准化，比较荧光强度的变化。

2 结果

2.1 APPswe/PSΔE9转基因小鼠鼠尾DNA鉴定结果

裂解鼠尾后，提取 DNA，分别扩增 APP，PS1基因，筛选鉴定阳性小鼠，部分检测结果见图1。

图1 APPswe/PSΔE9转基因小鼠鼠尾 DNA PCR鉴定的结果Fig.1 The PCR results of DNA from tails of APPswe/PSΔE9 mice.

2.2 APPswe/PSΔE9转基因小鼠脑组织中 miR-106b的表达情况

提取3月龄和6月龄 APPswe/PSΔE9转基因小鼠脑组织总RNA进行microRNA芯片的检测，同时以同月龄的野生型C57小鼠作为对照。芯片结果显示，与对照相比，miR-106b在AD模型小鼠脑组织中的表达存在差异。考虑到芯片结果可能存在的假阳性，采用real-time RT-PCR的方法对芯片结果进行验证，一共检测了12只小鼠，其中模型组6只，对照组6只，每组雌雄各半。Real-time RT-PCR的结果表明，与对照组相比，miR-106b在3月龄和6月龄APPswe/PSΔE9小鼠中表达水平升高，在9月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织中表达降低(图2)。

图2 miR-106b在APPswe/PSΔE9小鼠和对照小鼠中的表达情况Fig.2 The expression of miR-106b in APPswe/PSΔE9 mice and control mice

2.3 在miR-106b稳定转染细胞系中TGFBR2蛋白水平明显降低;抑制 miR-106b的表达后，TGFBR2蛋白水平增加

通过在miRNAs靶基因预测数据库TargerScan(www.targetscan.org)中的查询，我们发现TGFBR2 3’UTR存在两个miR-106b的预测结合位点。为了验证miR-106b与TGFBR2之间的关系，我们构建了miR-106b稳定转染细胞系，采用 Western blot的方法检测miR-106b稳定转染细胞系和对照细胞中TGFBR2蛋白的表达情况。结果表明，与对照组相比，miR-106b稳定转染细胞中，TGFBR2蛋白表达水平降低(图3A和 B)。当我们用针对 miR-106b的LNA(locked nucleic acid)探针抑制 miR-106b的表达后，TGFBR2的蛋白表达水平上升(图3C和D)。miRNAs可以通过两种方式抑制靶基因的表达，促进靶mRNA的降解或抑制靶mRNA的翻译。为了进一步确定miR-106b可能通过何种方式影响TGFBR2的表达，我们利用 real-time RT PCR的方法在miR-106b稳定转染细胞系和抑制miR-106b表达后的细胞中检测了TGFBR2 mRNA的水平。结果显示，与对照相比，无论是 miR-106b过表达还是抑制miR-106b的表达，TGFBR2 mRNA水平均无明显改变，这提示我们 miR-106b可能通过抑制 TGFBR2 mRNA的翻译来影响TGFBR2蛋白的表达。

图3 miR-106b高表达或低表达对TGFBR2蛋白表达的影响Fig.3 The effect of miR-106b over-expression or knockdown on TGFBR2 expression

图4 miR-106b和 TGFBR2 mRNA 3’UTR之间的关系Fig.4 Interaction of miR-106b with the 3’UTR of the TGFBR2 mRNA

图5 APPswe/PSΔE9转基因小鼠和对照小鼠脑组织中TGFBR2蛋白表达情况Fig.5 The expression of TGFBR2 protein in APPswe/PSΔE9 mice and control mice

2.4 miR-106b与 TGFBR2 mRNA 3’UTR 之间的相互作用

前面，我们已经提过在 TGFBR2 mRNA 3’UTR中存在2个可能与miR-106b结合的潜在位点。为了验证 miR-106b是否能与 TGFBR2 mRNA 3’UTR直接结合，我们将包括这2个位点在内的野生型或者含有突变位点的 TGFBR2的3’UTR克隆至 psi-CHECKTM-2载体的海肾荧光素酶开放读码框架的下游，构建含TGFBR2-3’UTR及突变的TGFBR2-3’UTR的荧光素酶报告载体。然后，我们将所构建的TGFBR2荧光素酶报告载体与miR-106b表达载体或阴性对照质粒共转染至293T细胞中，转染后48 h，检测荧光素酶的活性。实验结果表明，与对照相比，miR-106b的过表达可以抑制荧光素酶的活性;突变预测结合位点1之后，miR-106b丧失对荧光素酶活性的抑制作用;突变预测结合位点2对 miR-106b抑制荧光素酶活性的作用没有明显影响;将2个预测位点均突变之后，与仅突变预测结合位点1相同，miR-106b丧失抑制荧光素酶活性的作用(图4)。上述的实验结果提示我们miR-106b可以通过预测结合位点1作用于 TGFBR2 mRNA的3’UTR序列，从而抑制TGFBR2蛋白的表达。

2.5 在APPswe/PSΔE9小鼠脑组织中 TGFBR2蛋白的表达水平

为了了解在AD模型小鼠脑组织中TGFBR2蛋白的表达情况，我们提取3月龄、6月龄、9月龄和12月龄小鼠脑组织的总蛋白，采用Western blot的方法进行分析。实验结果表明，与同月龄的野生型对照小鼠相比，3、6、9和 12月龄 APPswe/PSΔE9转基因小鼠脑组织中，TGFBR2表达水平均降低(图5)。

3 讨论

实验表明 miR-106b和TGFBR2在 AD模型小鼠脑组织中表达异常;通过miR-106b过表达和抑制miR-106b的表达证实miR-106b与TGFBR2的表达呈负相关;荧光素酶报告实验证实miR-106b可以直接调控TGFBR2蛋白的表达。TGFBR2是一种高亲和力的 TGF-β的跨膜受体，TGF-β信号通路与 AD的发病密切相关，实验表明miR-106b可能通过调控TGFBR2蛋白的表达，影响 TGF-β信号通路的活性从而参与AD的发病。

Hébert等［5］的研究发现 miR-106b 在 AD 患者的脑组织中表达降低。我们的研究显示3月龄和6月龄AD模型小鼠脑组织中miR-106b的表达升高，9月龄 AD模型小鼠脑组织中 miR-106b的表达降低，与Hébert等的研究结果不完全相符。我们认为Hébert等未对 AD患者进行分期，其研究发现的miR-106b表达水平的降低是指miR-106b表达的平均水平降低。本实验所选用AD模型小鼠均一性较好，3月龄和6月龄小鼠属于AD发病的早期，9月龄小鼠属于 AD发病的中晚期。因此，我们认为miR-106b的表达可能与 AD发病的分期有关，在AD发病的早期 miR-106b的表达升高，在 AD发病的中晚期miR-106b的表达降低。

我们的研究结果显示 TGFBR2在 3、6、9、12月龄小鼠脑组织中表达均降低，与 Tesseur等［6］在 AD患者脑组织中的研究结果相符，TGFBR2蛋白在AD发病的早期即降低。但是，miR-106b与TGFBR2蛋白的表达在AD模型小鼠脑组织中并不总呈负相关，9月龄小鼠中miR-106b和TGFBR2蛋白的表达均降低。我们分析认为AD模型小鼠体内环境是复杂的，TGFBR2蛋白的表达除了受到miR-106b表达的影响外，还有其他因素影响其表达，TGFBR2蛋白的表达水平是这些因素综合作用的结果。Gebken等［7］报道TGF-β信号通路中配体的高表达能抑制受体的表达。文献报道，在AD的脑组织中TGF-β1的表达升高［8，9］，我们认为这可能也是 TGFBR2 蛋白表达降低的原因之一。

研究表明TGF-β信号通路异常与AD的发病密切相关，TGF-β信号通路可以作为治疗 AD的新靶点［4］。miRNAs在AD发病过程中发挥重要作用，日益成为人们研究的热点。我们的实验也为研究AD的新的治疗方法提供了思路，干扰与AD发病相关的miRNAs的表达可以作为AD治疗的一个新的方法。Krutzfeldt等［10，11］在这方面做了很好的尝试，用小的RNA寡核苷酸(例如antagomiRs、pre-miRs)，干扰内源性miRNAs的表达，从而起到相应的调控作用。

通过实验，我们发现TGFBR2是miR-106b的一个功能靶点，miR-106b可能通过调节TGFBR2的表达，从而参与 AD的发生。进一步验证了 miRNAs在神经系统退行性疾病中可能发挥的重要作用，为更好的理解神经系统退行疾病的发病机理及研究新的治疗方法提供了有益的帮助。

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The role of miR-106b in Alzheimer's Disease

WANG Hai-lin，ZONG Yuan-yuan，LIU Jia-lin，QIN Chuan
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，Key Laboratory of Human Disease Animal Models，State Administration of Tranditional Chinese Medicine，Beijing 10021，China)

Objective To explore the role of miR-106b in Alzheimer＇s disease.Methods A microRNA array was used for the analysis of microRNA expression in the brain tissue of 3-month-old and 6-month-old APPswe/PSΔE9 mice.The results of microRNA array were validated by real time PCR.The expression correlation between miR-106b and TGFBR2 was detected through construction of miR-106b stably transfected SH-SY5Y cell line and miR-106b knockdown.To determine whether miR-106b can directly regulate the expression of TGFBR2，The TGFBR2 3’UTR-luciferase reporter was constructed and luciferase reporter assay was performed.The protein level of TGFBR2 in brain tissue from APPswe/PSΔE9 mice and control mice was detected by Western blot.Results The expression of miR-106b was a increased in 3-month-old and 6-month-old APPswe/PSΔE9 mice and decreased in 9-month-old AD mice compared with that in age-matched controls.The expression of miR-106b and TGFBR2 was negatively correlated in vitro.The luciferase assay showed that there was a binding site for miR-106b in 3’UTR of TGFBR2 and miR-106b can directly regulate the expression of TGFBR2.The protein level of TGFBR2 was downregulated in 3-to 12-month-old APPswe/PSΔE9 mice.Conclusions Our results suggest that miR-106b may contribute to the pathogenesis of Alzheimer＇s disease，at least in part by affecting the expression of TGFBR2.

microRNA;miR-106b;Alzheimer＇s disease;TGFBR2;APPswe/PSΔE9 mice

Q95-33，R541

A

1005-4847(2011)01-0021-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.005

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以进行性痴呆为主要临床表现的大脑变性疾病，是导致老年人痴呆的主要原因。据统计：全球约有2千多万AD患者，并正以每年460万人的速度增加［1］。AD严重影响老年人的生活质量，给家庭和社会带来沉重的负担，是各国面临或将要面临的重要卫生和社会经济问题。然而，目前对于AD的发病机制尚不十分清楚且缺乏有效的治疗方法。MicroRNAs(miRNAs)是近年来发现的一种小调节RNAs，在转录后水平调节基因的表达，研究表明miRNAs的功能异常可能参与了 AD的发生［2，3］。miR-106b属于miR-17家族、miR-106b～25群簇，在前列腺癌、多发性骨髓瘤、胃肠癌等多种类型的肿瘤组织中高表达，其表达与调控细胞周期基因的表达密切相关。TGF-β信号通路在调节细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要作用，其信号转导的异常与神经系统的发育、分化、炎症及多种神经系统疾病相关。近年来，越来越多的研究表明 TGF-β信号通路异常在AD的发病过程中发挥重要重用［4］。然而，在AD中TGF-β信号通路的异常是否与 miRNAs的表达相关，目前这方面的研究还比较少。本实验利用芯片和real time PCR的方法证实在AD模型小鼠中miR-106b的表达异常，探讨miR-106b是否可以通过调控TGF-β信号通路，从而参与AD的发病。

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项基金(DWS200814)。

王海林，博士生，研究方向：神经退行性疾病发病机制。E-mail：wanghailin2005@126.com

秦川，博士生导师。E-mail：qinchuan@pumc.edu.cn

2010-08-20